Laserzellablation in intakten Drosophila-Larven zeigt synaptische Konkurrenz
Summary
Dieses Protokoll demonstriert die Laserzellablation einzelner Neuronen in intakten Drosophila-Larven . Die Methode ermöglicht es, die Wirkung der Verringerung der Konkurrenz zwischen Neuronen im sich entwickelnden Nervensystem zu untersuchen.
Abstract
Das Protokoll beschreibt die Ablation einzelner Neuronen mit einem 2-Photonen-Lasersystem im Zentralnervensystem (ZNS) von intakten Larven von Drosophila melanogaster . Mit dieser nicht-invasiven Methode kann das sich entwickelnde Nervensystem zellspezifisch manipuliert werden. Die Störung der Entwicklung einzelner Neuronen in einem Netzwerk kann genutzt werden, um zu untersuchen, wie das Nervensystem den Verlust des synaptischen Inputs kompensieren kann. Einzelne Neuronen wurden im Riesenfasersystem von Drosophila spezifisch abgetragen, wobei der Schwerpunkt auf zwei Neuronen lag: der präsynaptischen Riesenfaser (GF) und dem postsynaptischen tergotrochanteralen Motoneuron (TTMn). Das GF synapsiert mit dem ipsilateralen TTMn, das für die Fluchtreaktion entscheidend ist. Die Ablation eines der GFs im 3. Instar-Gehirn, kurz nachdem das GF mit dem axonalen Wachstum begonnen hat, entfernt die Zelle dauerhaft während der Entwicklung des ZNS. Das verbleibende GF reagiert mit dem fehlenden Nachbarn und bildet ein ektopisches synaptisches Terminal zum kontralateralen TTMn. Dieses atypische, bilateral symmetrische Terminal innerviert beide TTMns, wie durch Farbstoffkopplung nachgewiesen wird, und steuert beide Motoneuronen, wie elektrophysiologische Assays zeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ablation eines einzelnen Interneurons einen synaptischen Wettbewerb zwischen einem bilateralen Neuronenpaar zeigt, das den Verlust eines Neurons kompensieren und die normalen Reaktionen auf den Escape-Kreislauf wiederherstellen kann.
Introduction
Die Laserablation ist ein bevorzugtes Werkzeug zum Sezieren neuronaler Schaltkreise in einer Vielzahl von Organismen. Es wurde in genetischen Modellsystemen wie Würmern und Fliegen entwickelt und im gesamten Tierreich eingesetzt, um die Struktur, Funktion und Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen 1,2,3. Hier wurde die Einzelneuronenablation eingesetzt, um zu untersuchen, wie Neuronen während des Schaltkreisaufbaus in Drosophila interagieren. Das Fluchtsystem der Fliege ist ein beliebter Schaltkreis für die Analyse, da es die größten Neuronen und die größten Synapsen in der erwachsenen Fliege enthält, und der Schaltkreis wurde in denletzten Jahrzehnten gut charakterisiert 4. Die Rolle, die Neuron-Neuron-Interaktionen beim Aufbau des Riesenfaser-Schaltkreises spielen, ist ein Schwerpunkt dieser Forschung.
Eine Art von Interaktion, die seit der Arbeit von Hubel und Wiesel in den 1960er Jahren ein Schwerpunkt der Neurowissenschaften ist, ist der “synaptische Wettbewerb“5,6. In diesem Protokoll wurde die Laserablation verwendet, um die Rolle der Konkurrenz durch Einzelzellablation im Riesenfasersystem (GFS) von Drosophila zu überdenken, wo die molekularen Grundlagen der Phänomene entdeckt werden könnten.
Die Ablation von Neuronen in der sich entwickelnden Fliege war aus einer Vielzahl von Gründen schwierig, darunter die Visualisierung der Zielneuronen, die Präzision der Ablationsmethode und das Überleben der Probe. Um diese Probleme im GFS zu überwinden, wurde das UAS/Gal4-System7 verwendet, um die interessierenden Neuronen zu markieren, und ein Zwei-Photonen-Mikroskop wurde verwendet, um die präsynaptische Riesenfaser oder das postsynaptische Sprungmotoneuron (TTMn) zu entfernen.
Um die Rolle zu bestimmen, die benachbarte bilaterale Neuronen bei der Anpassung der synaptischen Konnektivität und der synaptischen Stärke im GFS spielen, wurde in dieser Studie eines der bilateralen Neuronenpaare (entweder präsynaptisches GF oder postsynaptisches Motoneuron) kurz vor der Puppenentwicklung deletiert. In diesem Entwicklungsstadium ist die GF-Axonogenese noch nicht abgeschlossen8. Anschließend wurden die GF-Struktur und die Funktion des synaptischen Schaltkreises beim Erwachsenen untersucht, wobei besonderes Augenmerk auf den Output des verbleibenden GF gelegt wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zellablation mit einem 2-Photonen-Mikroskop erwies sich als sehr erfolgreiche Methode, um die Entwicklung neuronaler Schaltkreise in Drosophila zu manipulieren. Da diese Methode nicht-invasiv ist, verursacht sie nur minimalen Schaden für das Tier. Die Daten unterstützen die Nützlichkeit dieser zellspezifischen Manipulation bekannter Schaltkreise.
Entscheidend für den Erfolg der Ablation war die Auswahl des am besten geeigneten Gal4-Treibers. Da das GFS gut untersucht ist, wurd…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Experimente am 2-Photonen-Mikroskop wurden im Advanced Cell Imaging Core des Stiles-Nicholson Brain Institute der FAU durchgeführt. Wir danken der Jupiter Life Science Initiative für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
Riferimenti
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