L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique
Summary
Ce protocole démontre l’ablation cellulaire au laser de neurones individuels chez des larves de drosophile intactes. La méthode permet d’étudier l’effet de la réduction de la compétition entre les neurones du système nerveux en développement.
Abstract
Le protocole décrit l’ablation d’un seul neurone avec un système laser à 2 photons dans le système nerveux central (SNC) de larves intactes de Drosophila melanogaster . En utilisant cette méthode non invasive, le système nerveux en développement peut être manipulé d’une manière spécifique à la cellule. Perturber le développement de neurones individuels dans un réseau peut être utilisé pour étudier comment le système nerveux peut compenser la perte d’entrée synaptique. Les neurones individuels ont été spécifiquement ablatés dans le système de fibres géantes de la drosophile, en mettant l’accent sur deux neurones : la fibre géante présynaptique (GF) et le motoneurone tergotrochantéral postsynaptique (TTMn). Le GF fait synapse avec le TTMn ipsilatéral, ce qui est crucial pour la réponse de fuite. L’ablation de l’un des GF dans le cerveau du 3estade, juste après le début de la croissance axonale, élimine définitivement la cellule pendant le développement du SNC. Le GF restant réagit au voisin absent et forme une terminaison synaptique ectopique au TTMn controlatéral. Cette terminaison atypique, à symétrie bilatérale, innerve les deux TTMn, comme le démontre le couplage des colorants, et entraîne les deux motoneurones, comme le démontrent les tests électrophysiologiques. En résumé, l’ablation d’un seul interneurone démontre une compétition synaptique entre une paire bilatérale de neurones qui peut compenser la perte d’un neurone et restaurer des réponses normales au circuit d’échappement.
Introduction
L’ablation au laser est un outil privilégié pour disséquer les circuits neuronaux dans une grande variété d’organismes. Développé dans des systèmes génétiques modèles comme les vers et les mouches, il a été appliqué dans tout le règne animal pour étudier la structure, la fonction et le développement du système nerveux 1,2,3. Ici, l’ablation d’un seul neurone a été utilisée pour étudier comment les neurones interagissent lors de l’assemblage des circuits chez la drosophile. Le système d’échappement de la mouche est un circuit de prédilection pour l’analyse car il contient les plus grands neurones et les plus grandes synapses de la mouche adulte, et le circuit a été bien caractérisé au cours des dernières décennies4. Le rôle que jouent les interactions neurones-neurones dans l’assemblage du circuit de la fibre géante est au cœur de cette recherche.
Un type d’interaction qui a été un point central en neurosciences depuis les travaux de Hubel et Wiesel dans les années 1960 est la « compétition synaptique »5,6. Dans ce protocole, l’ablation laser a été utilisée pour revisiter le rôle de la compétition par ablation unicellulaire dans le système de fibres géantes (GFS) de la drosophile, où les fondements moléculaires du phénomène pourraient être découverts.
L’ablation des neurones chez la mouche en développement a été difficile pour diverses raisons, notamment la visualisation des neurones cibles, la précision de la méthode d’ablation et la survie de l’échantillon. Pour surmonter ces problèmes dans le GFS, le système UAS/Gal47 a été utilisé pour marquer les neurones d’intérêt, et un microscope à deux photons a été utilisé pour retirer la fibre géante présynaptique ou le motoneurone de saut postsynaptique (TTMn).
Dans cette étude, pour déterminer le rôle que jouent les neurones bilatéraux voisins dans l’ajustement de la connectivité synaptique et de la force synaptique dans le GFS, l’une des paires bilatérales de neurones (GF présynaptique ou motoneurone postsynaptique) a été supprimée juste avant le développement de la nymphe. À ce stade de développement, l’axonogenèse de GF n’est pas terminée8. La structure GF et la fonction du circuit synaptique chez l’adulte ont ensuite été examinées, avec une attention particulière accordée à la sortie du GF restant.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ablation cellulaire à l’aide d’un microscope à 2 photons s’est avérée être une méthode très efficace pour manipuler le développement des circuits neuronaux chez la drosophile. Comme cette méthode est non invasive, elle cause des dommages minimes à l’animal. Les données soutiennent l’utilité de cette manipulation spécifique aux cellules de circuits connus.
Le choix du pilote Gal4 le plus approprié était crucial pour le succès de l’ablation. Comme le GFS …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Des expériences sur le microscope à 2 photons ont été réalisées dans le FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Nous tenons à remercier la Jupiter Life Science Initiative pour son soutien financier.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
Riferimenti
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