Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

Sai Nikhil Subraveti; Brian K. Wilson; Navid Bizmark; Jason Liu; Robert  K. Prud&#39;homme

doi:10.3791/67047

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioingegneria

Lipid Nanopartiküllerinin Kapalı Çarpmalı Jet Karıştırıcılarda Türbülanslı Akışla Sentezlenmesi

Published: August 23, 2024

doi:

10.3791/67047

Sai Nikhil Subraveti¹, Brian K. Wilson¹, Navid Bizmark¹, Jason Liu¹, Robert K. Prud’homme¹

¹Department of Chemical and Biological Engineering,Princeton University

Summary

İki jetli bir CIJ ve dört jetli çok girişli girdap karıştırıcı (μMIVM) dahil olmak üzere sınırlı çarpma jeti (CIJ) karıştırıcı teknolojileri kullanılarak lipid nanopartiküllerinin (LNP’ler) sentezlenmesi için ayrıntılı bir protokol gösterilmiştir. CIJ mikserleri, tekrarlanabilir, türbülanslı mikro karıştırma ortamları oluşturur ve bu da monodispers LNP’lerin üretilmesiyle sonuçlanır.

Abstract

Lipid nanopartikülleri (LNP’ler), iki COVID-19 haberci RNA (mRNA) aşısının onaylanması ve küresel kullanımıyla kanıtlandığı gibi, terapötik dağıtım araçları olarak muazzam potansiyellerini göstermiştir. Küçük ölçekte, LNP’ler genellikle mikroakışkanlar kullanılarak yapılır; Bununla birlikte, bu cihazların sınırlamaları, büyük ölçekte kullanımlarını engellemektedir. COVID-19 aşıları, kapalı çarpma jeti (CIJ) türbülanslı karıştırıcılar kullanılarak büyük miktarlarda üretilmektedir. CIJ teknolojisi, üretim hacimlerine göre ölçeklendirilebileceğinden emin olarak laboratuvar ölçeğinde üretim yapılmasını sağlar. CIJ karıştırmadaki temel kavramlar, karıştırma uzunluğu ve zaman ölçeğinin karıştırma boşluğundaki türbülans yoğunluğu tarafından belirlenmesi ve nanopartikül oluşumunun duvarlardan uzakta meydana gelmesi, yüzeylerde birikme ve kirlenme sorununu ortadan kaldırmasıdır. Bu çalışma, iki geometrili sınırlı çarpma jet karıştırıcı teknolojisini kullanarak LNP’ler yapma sürecini göstermektedir: iki jetli CIJ ve dört jetli çok girişli girdap karıştırıcı (MIVM). Her bir karıştırma geometrisinin avantajları ve dezavantajları tartışılmaktadır. Bu geometrilerde, LNP’ler, bir organik çözücü akışının (genellikle iyonlaşabilir lipitleri, ko-lipitleri ve stabilize edici PEG lipidlerini içeren etanol) sulu bir anti-çözücü akışı (RNA veya DNA içeren sulu tampon) ile hızlı bir şekilde karıştırılmasıyla oluşturulur. CIJ ve MIVM karıştırıcılar için çalışma parametreleri, kontrollü boyut, zeta potansiyeli, stabilite ve transfeksiyon etkinliği ile tekrarlanabilir LNP’ler hazırlamak için sunulmuştur. CIJ karıştırmaya kıyasla zayıf karıştırma (pipetleme çözeltileri) ile yapılan LNP’ler arasındaki farklar da sunulmaktadır.

Introduction

mRNA bazlı terapötikler, bulaşıcı hastalıklar, genetik bozukluklar ve kanserler dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıkların tedavisi ve önlenmesi için büyük potansiyele sahiptir¹. Hücre zarı boyunca pasif olarak yayılabilen küçük moleküllü terapötiklerin aksine, hücre içi iletim için nükleik asitlerin kapsüllenmesi gerekir². Kapsülleme, mRNA’ya hem yapı hem de stabilite sağlar, endositik yollar yoluyla hücre içi iletimlerini kolaylaştırır ve ayrıca nükleazlar³ gibi hücre içi ve hücre dışı bileşenlerden bozulmayı önler. mRNA’nın kapsüllenmesi ve verilmesi için inorganik nanopartiküller, polimerler, lipitler ve lipit benzeri malzemeler dahil olmak üzere bir dizi malzeme ve nanotaşıyıcı geliştirilmiştir¹. Bunlar arasında, LNP’ler mRNA bazlı terapötikler için en belirgin dağıtım platformu olarak ortaya çıkmıştır⁴.

LNP’ler dört lipid bileşeninden oluşur: iyonlaşabilir lipid, kolesterol, zwitteriyonik lipid ve PEG-lipid stabilizatörü⁵. mRNA iletimi için uygun iyonlaşabilir lipitler, lipid hidrofobikliği ile üçlü bir amin grubu^6’nın ayrışma sabiti (pKa) arasında dikkatli bir denge sergiler. İyonlaşabilir lipid pKa tipik olarak KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) ve ALC-0315⁷ gibi 6.0 ile 6.7 arasında bir pH’a sahiptir. İyonize olabilen lipid üzerindeki bu pKa kısıtlaması, hem nükleik asit polimerlerinin hidrofobik lipid tuzları olarak kapsüllenmesini hem de bir “endozom kaçış” işlemi yoluyla hücre içi iletimi sağlar. LNP’ler, tümü endozomun pH 7.4’ten pH ~ 5^8’e asitlenmesini içeren (çeşitli) endositoz yolları yoluyla bir hedef hücreye girer. İyonlaşabilir lipid pKa, LNP’lerin fizyolojik koşullar altında neredeyse nötr yüzeylere sahip olmasını, ancak asitleştirici bir endozomda^katyonik hale gelmesini sağlar 9. Bu pH yanıtı, Lipofektamin gibi transfeksiyon sistemlerinde kullanılan kalıcı katyonik lipidlerin aksine, yalnızca endozomal zarın seçici olarak bozulmasını, kapsüllenmiş nükleik asit polimerinin salınmasını sağlar ve hücre canlılığını korur. Kolesterol, LNP yapısında lipid akışkanlığını artıran hidrofobik, interstisyel bir moleküldür. Zwitteriyonik lipid yapısal bir rol oynar ve LNP yüzeyinde bir çift tabaka oluşturur. Poli (etilen glikol) -lipid (PEG-lipid), LNP’lerin toplanmasına direnen LNP yüzeyine bir polimerik sterik stabilizatör vererek LNP stabilitesini artıran bir kolloidal stabilizatördür. Bu, özellikle hidrofobik bir yağ gibi davranan iyonlaşabilir lipidin serbest baz formunu yeniden oluşturan pH’daki değişiklikler sırasında LNP’yi stabilize eder. Onpattro (patisiran) tarifi (bundan böyle LNP formülasyonu olarak anılacaktır) genellikle iyonize edilebilir lipid MC3, kolesterol, distearoilfosfatidilkolin (DSPC) ve sulu bir RNA¹⁰ çözeltisine karşı karıştırılmış etanol içinde çözülmüş PEG2000-DMG ile LNP formülasyonu için bir başlangıç noktası olarak kullanılır.

Nükleik asit polimerlerini kapsülleyen LNP’leri üretmek için çeşitli teknikler kullanılabilir ve bunların çoğu, lipitler içeren bir etanol akışının, ilgilenilen nükleik asidi (siRNA, mRNA veya DNA) içeren sulu bir akışla hızlı bir şekilde karıştırılması ortak temasına dayanır9,11,12,13,14. Bu bağlamda, pipet karıştırma ve vorteks karıştırma gibi yığın karıştırma işlemleri, karmaşık aletlerin kullanılması ihtiyacını ortadan kaldıran LNP’ler oluşturmak için basit bir strateji sunar¹². Bununla birlikte, yığın karıştırma, bileşenlerin homojen bir dağılımını sağlamaz, bu da partiden partiye önemli değişkenlik ile birlikte optimal olmayan bir LNP boyut dağılımına yol açar¹⁵.

Laboratuvarlar, karıştırma koşulları üzerinde daha hassas kontrol sağlayarak tekrarlanabilir LNP’ler elde etmek için rutin olarak mikroakışkan karıştırma tekniklerini kullanır 12,13,16. Yine de, bir mikroakışkan odasındaki küçük uzunluk ölçekleri ve düşük hızlar nedeniyle doğal olan mikroakışkan cihazlardaki laminer akış koşulları, nispeten yavaş çözücü/çözücü karışımı^{ile sonuçlanır 17}. Küçük hazne boyutları, LNP’lerin GMP üretimi için gereken verimi ve ölçeklenebilirliği ciddi şekilde sınırlamaktadır, ancak araştırmacılar, üretim hacimlerini ölçeklendirmeye çalışmak için mikroakışkan odaları paralelleştirmiştir¹⁵. Paralelleştirilmiş bir mikroakışkan geometrisi, büyük hacimli işleme sırasında yüzeylere lipid adsorpsiyonu problemini ortadan kaldırmaz, bu problem genellikle karıştırma cihazının “kirlenmesi” olarak adlandırılır ve mikroakışkanların ölçek büyütmesini endüstriyel ölçekli üretim için zorlaştıran akışların tekdüzeliği ve stabilitesi ile ilgili problemler vardır^18,19. İlaç şirketlerinin COVID-19 aşısı mRNA-LNP’leri²⁰ üretmek için türbülanslı çarpma jet karıştırıcıları kullanması şaşırtıcı değildir.

RNA yüklü LNP’lerin üretim süreci, RNA yükünü içeren sulu bir tampon akışının, dört farklı lipid bileşenini içeren bir etanol akışı ile harmanlanmasını gerektirir. Bu formülasyonlar, sulu ve etanolik akışlar karıştıkça iyonlaşabilir lipidi yükleyen pH’ı 4.0 veya daha düşük olan asidik bir tampon kullanır. Pozitif yüklü iyonlaşabilir lipitler, negatif yüklü RNA’larla elektrostatik olarak etkileşime girerek hidrofobik bir RNA-lipid tuzu oluşturur. RNA-lipid tuzu da dahil olmak üzere hidrofobik lipid türleri, karışık çözücülerde çökelir ve hidrofobik çekirdekler oluşturur. Bu çekirdekler, zwitteriyonik lipid ve kolesterolün çökeltilmesi yoluyla, LNP’lerin yüzeyinde yeterli pegile lipidin adsorbe olduğu kritik bir noktaya ulaşana kadar büyür ve daha fazla büyüme-çekirdeklenme ve büyüme mekanizmasını durdurur 21,22,23. Lipitlerin çökeldiği ve LNP’lerin oluştuğu ölçüde, lipit çözeltisine sulu tampon eklenmesi, iki farklı zaman ölçeğine bağlıdır: çözücü-anti-çözücü karıştırma periyodu, τ_karışımı ve çekirdek büyüme periyodu, τ_agg. Da = τ_karışımı/τ_agg olarak tanımlanan boyutsuz Damköhler sayısı, bu zaman ölçekleri²⁴ arasındaki etkileşimi yakalar. Yavaş karıştırma durumlarında (Da > 1), LNP’lerin nihai boyutu taşıma kontrollüdür ve karıştırma süresine göre değişir. Tersine, hızlı karıştırma sırasında (Da < 1), sıvı Kolmogrov uzunluğunda çizgilere veya katmanlara ayrılır, bu sayede LNP oluşumu yalnızca her bir bileşenin moleküler difüzyonu tarafından yönetilir ve LNP oluşumunun homojen kinetiği ile sonuçlanır. İkinci senaryoya ulaşmak, lipit konsantrasyonunun kritik bir eşiği aşmasını ve tek tip homojen çekirdeklenmeye elverişli bir aşırı doygunluk durumu oluşturmasını gerektirir.

τ_agg’nin birkaç on ila birkaç yüz milisaniye arasında değiştiği tahmin edilmektedir²⁵. En temel konfigürasyonunda, biri lipitli etanol içeren ve diğeri RNA kargolu sulu bir tampon içeren iki akış, “kapalı çarpma jeti” (CIJ) karıştırıcı olarak bilinen bir odaya enjekte edilir. Türbülanslı girdaplar, uygun hızlarda çalıştırıldığında 1,5 ms içinde 1 μm’lik çözücü/antisolvent çizgileme uzunluğu ölçekleri üretir. Akış hızları ve karıştırma geometrisi, doğrusal momentumun akışları karıştıran türbülanslı girdaplara dönüşümünü belirler. Bu, akış hızlarıyla doğrusal orantılı olan boyutsuz sayı olan Reynolds sayısı (Re) ile parametreleştirilir. Re, Re = Σ (V_iD_i/v_i) değerinden hesaplanır, burada V_i her buhardaki akış hızıdır, v_i her akışın kinematik viskozitesidir ve D_i , 2 jetli CIJ cihazlarında akış giriş çapıdır²⁶ veya 4 jetli MIVM’lerde^{oda çapı 27}. Not: CIJ için yapılan bazı referanslar, Re^28’i tanımlamak için yalnızca tek bir jet çapı ve hızı kullanır. Re, bir mikroakışkan cihazında 1-100 aralığındayken, CIJ cihazlarında 125.000’lik Re elde edilebilir. Bir CIJ karıştırıcıda, eşit momentumlu akışlar çarpışır ve çarpma üzerine momentumlarını türbülanslı karışım olarak dağıtır, bu da küçük Kolmogorov mikro ölçekleri ve küçük Damköhler sayısı nedeniyle verimli mikro karıştırmaya yol açar. Başka bir karıştırıcı türü, dört akışın merkezi bir odaya yönlendirildiği “çoklu girişli girdap karıştırıcı” dır (MIVM). Bu kurulumda, kapalı karıştırma haznesine sürekli akışlar, iyi tanımlanmış bir karıştırma süresi ölçeği sağlar. Tüm akışkan elemanlar, her iki mikser tipinde de yüksek enerjili karıştırma bölgesinden geçer. Buna karşılık, T-bağlantıları gibi basit karıştırma cihazları, bir karıştırma bölgesi sağlayan bir oda içermez, bu da gelen akış momentumunun türbülanslı girdap oluşumundan ziyade büyük ölçüde çıkış yönüne saptırılması nedeniyle iki akışın daha az karışmasına neden olur. Hem CIJ hem de MIVM mikserler, toplu veya sürekli modlarda çalıştırılabilir ve çeşitli ölçeklerde LNP üretimi için esneklik sunar.

Bu protokol, iki sınırlı çarpma jet teknolojisi kullanılarak en uygun LNP formülasyonlarının nasıl yapıldığını açıklar: 2 jetli CIJ ve 4 jetli MIVM karıştırıcılar. CIJ ve MIVM karıştırıcıların çalışması daha önce hidrofobik çekirdek malzemeleri²⁹ ile NP’lerin hazırlanması için gösterilmiştir. Bu mikserlerle NP’lerin oluşumu hakkında ek bir kaynak olarak bu makale ve videoya başvurulmalıdır. Bu güncelleme, lipid bazlı NP oluşumuna odaklanmaktadır. Mikro karıştırma koşullarını değiştirerek LNP’lerin boyutunu ayarlama yeteneği gösterilmiştir. Ek olarak, CIJ teknolojilerinin, zayıf pipet karışımı kullanılarak yapılan LNP’lerle karşılaştırıldığında, HeLa hücrelerinde gelişmiş in vitro transfeksiyon verimliliklerine sahip kararlı, monodispers LNP’lerin oluşturulmasındaki faydası gösterilmiştir. Ayrıca, her bir CIJ karıştırma geometrisinin avantajları ve dezavantajları, bu karıştırıcıların ölçeklendirilmesi için gereken uygun koşullarla birlikte tartışılmaktadır.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. 1. Tamponların, çözücü ve çözücü akışlarının hazırlanması Bir patisiran LNP formülasyonu10 yapmak için tüm lipid bileşenlerini Tablo 1’de gösterildiği gibi belirli kütle konsantrasyonlarında etanol içinde çözün. Kullanmadan önce, çökelmiş katıları yeniden çözmek için çözeltileri hafif sonikasyon ile 37 ° C’ye ısıtın.NOT: Birkaç mililitrelik daha büyük stok çözeltileri hazırlanabilir ve 4 °C’de saklanabilir. 186 mg sodyum asetat ve 464 mg asetik asidi 80 mL nükleaz içermeyen suda birleştirerek 100 mM, pH 4 konsantrasyonunda bir asetat tampon stok çözeltisi hazırlayın. PH’ı gerektiği gibi konsantre HCl veya NaOH ile ayarlayın ve son hacmi 100 mL’ye kadar tamamlayın. 23.82 g HEPES tuzunu 80 mL nükleaz içermeyen suda çözerek 1 M, pH 7.5 konsantrasyonda bir HEPES tampon stok çözeltisi hazırlayın. PH’ı gerektiği gibi konsantre HCl veya NaOH ile ayarlayın ve son hacmi 100 mL’ye kadar tamamlayın. 30 mM asetat tamponunda 300 μg/mL’lik bir RNA çözeltisi üretmek için ilgilenilen nükleik asit polimerini ve 100 mM asetat tampon stoğunu nükleaz içermeyen su ile seyreltin. Tasarlanan deneyler için yeterli hacimde çalışma solüsyonu hazırlayın ve bu protokol hem CIJ hem de MIVM mikserleri için toplam 1500 μL gerektirir.NOT: Tedarikçiden elde edilen RNA, tipik olarak 10 mg/mL (maya RNA’sı) veya 1 mg/mL (lusiferaz kodlayan mRNA, LucRNA veya GFP kodlayan mRNA, GFP-RNA) konsantrasyonunda uygun bir tamponda olacaktır. Maya RNA’sı, çökeltiler için düşük maliyetli bir model RNA olarak kullanılabilir. 2. İki jetli CIJ karıştırıcı kullanılarak LNP’lerin formülasyonu Ekipmanın hazırlanması ve temizlenmesiCIJ mikserlerini kullanmadan hemen önce etanol ile yıkayarak temizleyin. İki adet 5 mL’lik şırıngayı etanol ile doldurun ve her birini CIJ’nin bir giriş portuna kilitleyin. Şırıngaları hızla bastırın ve mikser atık suyunu atık olarak toplayın.NOT: CIJ karıştırıcılar daha önce açıklandığı gibi yapılabilir ve çalıştırılabilir29. CIJ karıştırıcıyı tutmak için bir halka standı, santrifüj tüpü tutucusu veya Erlenmeyer şişesi dahil olmak üzere çeşitli destek sehpaları kullanılabilir. CIJ tedarikçileri, Malzeme Tablosunda ve Ek Dosya 1’de listelenmiştir. Etanol yıkama şırıngalarını CIJ’den çıkarın. Bu şırıngalar, CIJ’nin ek etanol durulamaları için saklanabilir ve yeniden kullanılabilir. Giriş adaptörlerinden kuru bir nitrojen akışı üfleyerek CIJ’in dahili kanallarını kurutun. Nitrojen yoksa yalnızca pompa yağı buharı veya aerosollerle kirlenmemiş kuru, filtrelenmiş hava kullanın. Solvent ve antisolvent akışlarının hazırlanmasıLipid stok çözeltilerini karıştırın ve 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde Tablo 1’de listelenen 6 mg / mL lipid çözeltisinden 500 μL üretmek için ilave etanol ile seyreltin.NOT: Bu formülasyon, 50 mol MC3, mol DSPC, 38.5 mol kolesterol ve 1.5 mol DMG-PEG2000 içeren yaygın olarak kullanılan Onpattro bileşimidir. 100 mM pH 4 asetat tampon stoğunu, CIJ karıştırıcı atık su söndürme banyosu olarak toplam 4 mL hacimde 10 mM’ye seyreltin.NOT: Söndürme banyosuna manyetik bir karıştırma çubuğu da eklenebilir. 1.4. adımda hazırlanan 500 μL RNA solüsyonunu 1 mL’lik bir şırıngada çekin. Şırıngayı ters çevirin ve nükleik asit polimeri içeren bu sulu antisolvent akımından herhangi bir havayı dışarı atın. Adım 2.2.1’de hazırlanan lipit çözeltisinin 500 μL’sini 1 mL’lik bir şırıngada çekin. Şırıngayı ters çevirin ve lipit içeren bu etanolik çözücü akışından herhangi bir havayı dışarı atın. CIJ mikserde LNP üretimiTemiz CIJ mikserini söndürme banyosu şişesinin üzerine yerleştirin.NOT: Bir halka stand kelepçesi veya tüp rafı, CIJ mikser için uygun bir destek sağlar. Tipik bir CIJ kurulumu için Şekil 1A’ya bakın. Adım 2.2.3 ve adım 2.2.4’te doldurulan iki şırıngayı CIJ mikser giriş portlarına eşleştirin. Çözücü ve antiçözücü akışlarını karıştırmak ve söndürme banyosunda lipit NP’leri toplamak için her iki şırıngayı da hızla bastırın.NOT: şırıngalar hızlı bir şekilde (1 saniyenin altında), ancak sorunsuz ve düzgün bir şekilde ilerletilmelidir. Asimetrik akış veya yavaş akış, polidispers, büyük LNP’ler üretecektir. Şırıngalar hala takılıyken CIJ mikserini söndürme banyosunun üzerinden çıkarın.NOT: Şırıngaları çıkarmayın veya tutma hacminin söndürme banyosuna akmasına izin vermeyin, çünkü bu malzeme zayıf bir şekilde karıştırılır ve söndürme banyosuna karıştırılırsa üretim dağılım özelliklerini olumsuz yönde etkiler. CIJ’yi bir atık kabının üzerinde tutun ve şırıngaları çıkarın, böylece kalan tutma hacminin atık kabına akmasına izin verin. Bu şırıngaları atın ve temizleme işlemini bölüm 2.1’de açıklandığı gibi tekrarlayın. CIJ ile üretilen LNP’leri aşağıdaki bölüm 5’te açıklandığı gibi analiz edin. 3. Dört jetli MIVM karıştırıcı kullanılarak LNP’lerin formülasyonu Ölçekli üretim için kullanılan daha büyük modellerden ayırt etmek için mikro boyutlu MIVM (μMIVM) olarak adlandırılan bir MIVM mikserinin montajıBir MIVM mikseri monte etmek için gereken tüm bileşenleri toplayın: alt alıcı, karıştırma geometrisi diski, üst disk, O-ring ve anahtar anahtarı.NOT: MIVM yapımı, montajı ve işletimi daha önce hidrofobik türlerin kapsüllenmesi için gösterilmiştir ve tedarikçiler Ek Dosya 1 ve Malzeme Tablosu29’da listelenmiştir. Bileşenlerin şeması ve mikser standı terminolojisi için Şekil 2’ye bakın. O-ringi karıştırma diskindeki oluğa oturtun. Karıştırma diski deliklerini üst diskteki mandallarla hizalayın ve O-ringi yerinden çıkarmadan bunları birbirine itin. Eşleşen karıştırma diskini, O-ringi ve üst disk tertibatını alt alıcıya gevşek bir şekilde vidalayın.NOT: Bu adımdan önce çıkış borusunu alt alıcıdan çıkarın. Anahtar anahtarını kullanarak üst diski alt alıcıya sıkın.NOT: İplik sürtünmesi gözlenirse, üst disk dişlerine gıda veya farmasötik dereceli bir tutukluk önleyici bileşik uygulanabilir. MIVM’yi tamamlamak için çıkış borusu bağlantısını alt alıcıya takın ve sıkın. Monte edilmiş MIVM’yi, çıkış borusu destek plakasından çıkacak şekilde mikser standına monte edin.NOT: Mikser standındaki mekanik durdurucuların doğru şekilde yapılandırıldığından emin olmak için MIVM mikser standını ayarlama prosedürü periyodik olarak gerçekleştirilmelidir29. Solvent ve antisolvent akışlarının hazırlanmasıİki etanolik lipid çözücü akış çözeltisini, Tablo 2’de verildiği gibi 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde, lipid stok çözeltilerini seyrelterek ve 6 mg / mL’lik bir nihai lipid konsantrasyonuna ulaşmak için gerektiği kadar ilave etanol ekleyerek karıştırın.NOT: Bu, 2.2.1’deki ile aynı lipit çözeltisi bileşimidir, ancak toplam hacmi 1000 μL’dir. 100 mM pH 4 asetat tampon stoğunu, MIVM atık su söndürme banyosu olarak toplam 8 mL hacimde 10 mM’ye seyreltin.NOT: Söndürme banyosuna manyetik bir karıştırma çubuğu da eklenebilir. MIVM karıştırıcı kullanarak LNP’lerin formülasyonu8 mL’lik su verme banyosunu, çıkış borusu su verme banyosuna boşalacak şekilde mikser standının altına yerleştirin. Solvent ve antisolvent akışlarını künt uçlu bir iğne kullanarak 1 mL gaz geçirmez şırıngalara çekin. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın ve iğneyi atın. Şırıngadaki havayı ters çevirerek ve dışarı atarak her bir şırıngayı doldurun. Dört şırıngayı, aynı akışlar karşı taraflarda olacak şekilde saat yönünde (Şırınga 1-4, Tablo 2) miksere monte edin. Son görünüm şeması için Şekil 1B’ye bakın. Yatak muhafazasını mobil plakanın her iki yanında tutun. Mekanik durdurmalar nedeniyle sıkışma tehlikesi oluşturduğundan, parmaklarınızı muhafazanın alt yüzüne yerleştirmekten kaçının. Mobil plakayı, şırıngaların üzerine eşit şekilde oturana kadar dikkatlice indirin.NOT: Çalıştırmadan önce şırınga pistonlarının tümü eşit yükseklikte olmalıdır. Bu akış hacimleri için işlemi yaklaşık 0,5 s ila 1 s içinde tamamlamayı hedefleyerek plakaya sabit ve düzgün bir şekilde bastırın. LNP dispersiyonunu içeren söndürme banyosunu kapatın. Kullandıktan sonra aşağıdaki adım 3.5’teki talimatları izleyerek MIVM’nin temizliğini gerçekleştirin. Bir şırınga pompası tarafından tahrik edilen bir MIVM karıştırıcı kullanılarak LNP’lerin formülasyonuMIVM’yi adım 3.1’de açıklandığı gibi birleştirin. Çözücü ve antisolvent çözeltilerini istenen bileşimde ve gerekli formülasyon boyutu için yeterli bir hacimde hazırlayın (Tablo 3).NOT: Bunlar, sulu antisolvent (adım 1.4) ve etanolik çözücü (adım 3.2.1) akışlarıyla aynı bileşimlerdir, ancak Tablo 3’teki daha büyük şırınga hacimleriyle kullanım için ölçeklendirilir. Solüsyonları 20 mL hacimli gaz geçirmez şırıngalara yükleyin ve PTFE borularını ucuna bir luer adaptörü takılmış olarak takın. Şırıngaları ve hortumu, şırıngayı ve hortumu ters çevirerek ve ardından havayı dışarı atarak astarlayın. Şırıngaları bir şırınga pompasına monte edin ve şırıngaları Şekil 3A’da gösterildiği gibi MIVM üzerindeki karıştırıcı girişlerine takın.NOT: CIJ aynı şekilde pompalar aracılığıyla da çalıştırılabilir, ancak yalnızca bir antisolvent ve solvent akış şırıngası ile. 100 mM pH 4 asetat tampon stoğunu, MIVM atık su söndürme banyosu olarak toplam 320 mL’lik bir hacimde 10 mM’ye seyreltin. Söndürme banyosunu MIVM çıkışının altına yerleştirin. Şırınga pompasındaki hacimsel akış hızını 20 mL/dk’ya ayarlayın.NOT: Hacimsel akış hızları, farklı mikro karıştırma koşullarına sahip LNP’ler oluşturmak için şırınga pompasındaki değerler manuel olarak ayarlanarak 2 mL/dk ila 40 mL/dk arasında değiştirilebilir. Şırınga pompasını çalıştırın, ancak ilk 10 saniyelik atık suyun bir atık kabına akmasına izin verin. Bu 10 sn başlangıç akış periyodundan sonra MIVM atık suyunu söndürme banyosunda toplayın. Seçilen (20 mL/dk) hacimsel akış hızında yapılan LNP dispersiyonu içeren söndürme banyosunu çıkarın ve kapatın.NOT: Bu prosedür, uygun söndürme banyosu hacimleri seçilerek LNP’leri farklı akış hızlarında sentezlemek için tekrarlanabilir. Bir sonraki LNP sentezine başlamadan önce önceki akış hızı durumunda yapılan LNP’lerin toplanmasını önlemek için çıkış borusunun hacminin en az iki katını boşaltarak her deney arasında (akış hızını değiştirirken) MIVM’yi temizleyin. Kullanımdan sonra ekipman temizliğiŞırıngaları takılı tutarken mikseri standdan ayırın ve bir atık kabının üzerinde tutun. Şırıngaları çıkarın, tutma hacminin kabın içine akmasına izin verin. Ardından, mikser tertibatını baş aşağı tutun ve mikseri sökmek için anahtar anahtarını kullanın. Çıkış borusunu çözücü (örn. etanol) ile durulayın ve hava veya nitrojen ile kurulayın. Karıştırma geometrisini deiyonize su veya etanol gibi uygun bir çözücü ile durulayın, ardından etanol ile durulayın. Bileşenleri bir hava akımı veya nitrojen kullanarak kurutun. O-ringi deiyonize su ile durulayın ve kurulayın.NOT: O-ring gergin veya deforme olmuş görünüyorsa, kullanmadan önce gece boyunca kurumaya bırakın. Sarf malzemesi parçaları oldukları için büyük bir O-ring stoğu bulundurun. Şekil ertesi güne kadar düzelmezse, O-ringi atın. Yüzeyi ve şırınga bağlantılarını kurutmak için bir hava veya nitrojen akışı kullanarak üst diski çözücü ile iyice durulayın. Her şırıngayı iyi bir çözücü ile durulayın (örneğin, deiyonize su veya etanol). Bir sonraki kullanımdan önce etanol ile son bir durulama uygulayın ve havayla kurutun. 4. LNP’lerin sonradan işlenmesi Tampon değişimi ve etanol giderimiLNP dispersiyonunu, 20 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyaliz kartuşu ile uygun boyutta bir diyaliz kaseti kullanarak pH 7.4’te 10 mM’lik bir HEPES tamponuna karşı diyaliz edin.NOT: Bu adım hem kalan ‘luk etanolü uzaklaştırır hem de asetat tamponunu HEPES ile değiştirerek dispersiyon pH’ını arttırır. Stok 1 M HEPES tamponunu toplam 1 L hacimde 10 mM’ye seyreltin. LNP dispersiyonunu bir şırınga ve iğne kullanarak 12 mL’lik bir diyaliz kasetine yükleyin. Diyaliz kartuşunu 1 L HEPES tamponuna daldırın ve harici tamponu manyetik olarak karıştırın. Harici HEPES tamponunu 3 saat sonra değiştirin ve toplam 6 saatlik diyaliz süresi için 3 saat daha sonra diyaliz kartuşunu çıkarın. Diyaliz edilmiş LNP dispersiyonunu diyaliz kartuşundan çekin ve kullanılmış kartuşu atın. Ultrasantrifüjleme yoluyla LNP süspansiyon konsantrasyonuSüspansiyonu 100kDa30’luk bir MWCO ile uygun boyutta bir santrifüj filtreye pipetleyin.NOT: Santrifüj filtreler, genellikle 0,5 mL ila 12 mL arasında değişen çeşitli boyutlarda mevcuttur. Konsantrasyonu yaklaşık 5-20 kat artırmak için dispersiyonu 2000 x g’da 10-20 dakika (oda sıcaklığında) santrifüjleyin.NOT: Santrifüjleme sırasında, uygun miktarda sıvı kaldığından emin olmak için numuneyi her 5 dakikada bir kontrol edin. 5. LNP’lerin karakterizasyonu Dinamik ışık saçılımı (DLS) ile hidrodinamik çap ölçümleriHazırlanan LNP dispersiyonunun 750 μL veya 900 μL’sini (herhangi bir seyreltme olmadan) sırasıyla plastik bir mikro veya kare küvete dağıtın.NOT: Uygun küvetlerde daha küçük hacimler de kullanılabilir. LNP’lerin dağıldığı çözücü için uygun viskoziteyi ayarlayın (yani, hacimce etanol karışımı için 1,26 cP). 25 °C’de 173°’lik bir açıyla geri saçılan ışığı toplayın, ardından Stokes-Einstein modelini kullanarak LNP’nin boyut belirlemesi ve ISO standart belgesi 13321:1996 E’de tanımlandığı gibi ışık saçılma korelasyon fonksiyonu serisi genişlemesinin ilk kümülantı. Ölçümleri en az üç kez tekrarlayın. Zeta potansiyeli ölçümleriKatlanmış kılcal zeta-boyutlandırıcı hücrelere ~ 800 μL hazırlanmış LNP dispersiyonu ekleyin.NOT: Kılcal kanal içinde kabarcık sıkışmasını önlemek için, sıvının yarısı hücrelere dağıtılır, baş aşağı tutulur ve ardından döndürülür. Ölçümleri en az üç kez tekrarlayın.NOT: En iyi sonuç için tampon iletkenliği 0,2-2 miliSiemens/cm arasında olmalıdır. Ticari olarak temin edilebilen RNA miktar tayin kiti ile kapsülleme verimliliği (EE) ölçümleriTahlil kitinde sağlanan pH 7.5’te 20x Tris-EDTA (TE) tamponunun uygun miktarını, nükleaz içermeyen su kullanarak 1x konsantrasyona seyreltin. Ağırlıkça% 2’de bir Triton X-100 çözeltisi hazırlayın. Etanol içeriği hacimce 0.2’nin altında olan RNA için yaklaşık 0.6 μg/mL’lik bir toplam kütle konsantrasyonu elde etmek için 1x TE tamponunda uygun miktarda LNP dispersiyonunu seyreltin. Önceki adımdakine benzer numuneler hazırlayın, ancak ağırlıkça %0.5 Triton X-100 içeren, LNP’leri etkili bir şekilde çözen, sırasıyla Triton X-100’ün yokluğunda ve varlığında “serbest” ve toplam RNA konsantrasyonları arasındaki ayrımı kolaylaştıran. 0 μg/mL, 0.1 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.4 μg/mL, 0.6 μg/mL, 0.8 μg/mL ve 1.0 μg/mL konsantrasyonlarında uygun miktarlarda kontrol RNA solüsyonu hazırlayın.NOT: RNA kitinin başlangıçta seyreltilmesi gerekebilir. Önceki adımı tekrarlayın, ancak ağırlıkça %0,5 Triton X-100’de. Ribogreen boyasını (kitte verilir) 1x TE tamponunda 200 kez seyreltin. Triton X-100 olsun ya da olmasın, hazırlanan tüm kontrol RNA’sına ve numune çözeltilerine uygun hacimlerde seyreltilmiş Ribogreen boya ekleyin. Boya, hem kontrol RNA’sı hem de numune çözeltileri boyunca iki faktörde eşit olarak seyreltilmelidir. Sonuç olarak, boyanın toplam seyreltilmesi, tahlil kitindeki orijinal konsantrasyonunun 400 katıdır. Vorteks kapları karıştırın. Bir plaka okuyucuda analiz için 96 kuyulu, işlenmemiş, düz tabanlı, opak bir plaka hazırlayın. 100 μL hacimde numuneleri ve RNA kontrollerini plakanın ayrı hücrelerine dağıtın.NOT: Triton X-100 içeren çözeltilerde kabarcık oluşumuna dikkat edin. Her numune için en az 350 μL numune gerektiren en az üç kopya gerçekleştirilir. Plaka okuyucuyu kullanarak 485 nm’lik bir uyarma dalga boyunda ve 528 nm’lik bir emisyon dalga boyunda, okuma başına yaklaşık 10 s’lik bir aydınlatma süresiyle floresan yoğunluğunu kaydedin. Çalkalamaya gerek yoktur.NOT: EE, ‘den belirlenir, buradaTritonlu I veTritonsuz I, sırasıyla Triton X-100 olan ve olmayan üç numune kopyasının ortalama floresan yoğunluğunu temsil eder veTritonlu veTritonsuz a, sırasıylaTriton X-100 olan ve olmayan iki ortalama kalibrasyon eğrisine doğrusal uyumların eğimini gösterir, 31.

Representative Results

Optimal LNP formülasyonlarının taranması, uygun hızlarda çalıştırılmaları koşuluyla, iki akışlı CIJ türbülanslı karıştırıcılar kullanılarak nispeten küçük miktarlarda malzeme ile hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Şekil 3A’da gösterildiği gibi programlanabilir bir şırınga pompası tarafından çalıştırılan bir μMIVM karıştırıcısı, küçük, monodispers LNP’ler oluşturmak için kritik bir Reynolds sayısının üzerinde yeterli mikro karıştırma elde etmenin önemini vurgulamak için kullanılır. Tablo 3 , LNP’leri üretmek için kullanılan formülasyonların özetini içerir ve karıştırıcı kurulumu, adım 3.4’te belirtilen protokolü takip eder. LNP boyutları, Reynolds sayısının bir fonksiyonu olarak dinamik ışık saçılımı (DLS) ile karakterize edildi. Şekil 3B’de gösterildiği gibi, 5000’lik kritik bir Re’nin ötesinde, küçük ve monodispers LNP’ler gözlenir. Ayrıca, yüksek Reynolds sayılarına (~ 104-10 5), şırıngalara elde çalıştırma veya karıştırma standı kullanılarak eşit şekilde bastırıldığında erişilebilir ( Şekil 3B’de en sağdaki veri noktası). Şekil 2A’da gösterilen karıştırma standı, tüm şırıngaları aynı anda eşit şekilde bastırır27. Sonuç olarak, bu tür LNP’ler de en uygun boyutlara sahiptir. Yetersiz karıştırma ile (yani, çok küçük bir Re), daha büyük LNP’ler oluşur. Düşük (Fotoğraf 1) ve yüksek Re’de (Fotoğraf 2) oluşan LNP’leri temsil eden fotoğraflar Şekil 3B’de gösterilmektedir. Düşük Re’de yapılan numuneler bulanıktır, bu da büyük kolloidal ışık saçılma yapılarının varlığını gösterir (Tyndall etkisi), ancak yüksek Re’de oluşan LNP’ler, daha küçük kolloidlerden daha zayıf, maviye kayan saçılma nedeniyle berrak görünür. İyonlaşabilir lipitler, aksi takdirde aynı lipid formülasyonları ile üretilen LNP’lerin fizikokimyasal özelliklerini etkileyen farklı fiziksel-kimyasal özelliklere sahiptir. Bunu test etmek için bir CIJ karıştırıcı (Şekil 1A) kullanılır. Tablo 4 , FDA onaylı iki iyonlaşabilir lipid kullanılarak yapılan formülasyonları listeler: ALC-0315 ve MC3. Şekil 4A , ALC-0315’ten pH 5’te yapılan LNP’lerin ~80 nm olduğunu, MC3 kullanılarak yapılan LNP’lerin ise ~60 nm olduğunu göstermektedir. Ayrıca, pH 5’te, MC3-LNP’ler pozitif bir zeta potansiyeline (~28 mV) sahipken, ALC-LNP’ler nötr bir zeta potansiyeline (<10 mV) sahiptir. Yüzey yükündeki ve LNP'lerin toplam boyutundaki bu ayrım, iki lipitin pKa'sından kaynaklanır. MC3, ALC0315 (6.09) ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir pKa'ya (6.44) sahiptir32; bu nedenle, MC3 lipidlerinin daha yüksek bir fraksiyonu pH 5’te yüklenir. Her iki formülasyon da %1.5 mol PEG-lipid stabilizatörüne sahiptir; bununla birlikte, MC3-LNP’ler, difüzyonla sınırlı agregasyon sırasında LNP montajı sırasında daha büyük elektrostatik itmeler nedeniyle daha küçük bir boyutta stabilize olur, bu da daha küçük boyutta büyümeyi durdurur. Her iki formülasyon da Şekil 4B’de gösterildiği gibi yüksek kapsülleme verimlilikleri (% >90) gösterir. Lipitlerin kimyası, LNP’lerin performansının yanı sıra genel özelliklerinin belirlenmesinde çok önemlidir ve bu nedenle, hedef uygulamaya göre dikkatli bir şekilde seçilmelidirler. Her iki türbülanslı karıştırıcı geometrisi (adım 2.3 ve adım 3.3) kullanılarak yapılan LNP’ler benzer fizikokimyasal özelliklere sahiptir. Bu karşılaştırma, türbülanslı karıştırıcılar ile homojen olmayan karıştırma teknikleri arasındaki ayrımı daha fazla göstermek için, toplu pipet karıştırma gibi zayıf karıştırma tekniklerinden yapılan LNP’leri daha da kapsayacak şekilde genişletilmiştir (Şekil 1C). Tablo 5 , Şekil 5’te gösterildiği gibi LNP’leri yapmak için kullanılan formülasyonların özetini sağlar. Pipet karıştırma tekniği söz konusu olduğunda, eşit hacimlerde etanol ve sulu akışlar, 15-20 saniye boyunca yukarı ve aşağı pipetlenerek hızlı bir şekilde karıştırılır, ardından karışım pH 4’te bir asetat tampon banyosuna pipetlenir. Şekil 5A , söndürme 10 mM asetat tampon banyosundaki (pH 4, hacimce etanol) LNP’lerin boyutlarının, kullanılan karıştırıcı geometrisinden (CIJ veya MIVM) bağımsız olarak çarpıcı şekilde benzer ve küçük (~ 50 nm) olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, pipet karıştırma kullanılarak yapılan LNP’ler, türbülanslı karıştırıcılar kullanılarak yapılan LNP’lerin iki katı boyutundadır. Bu, farklı CIJ geometrilerinden yapılan LNP’lerin, yeterince yüksek hızlarda (kritik Reynolds sayısının üzerindeki türbülanslı rejim) yapıldığında benzer özellikler sergilediğini, zayıf karıştırmanın ise daha büyük, polidispers LNP’lerle sonuçlandığını göstermektedir. Daha sonra, LNP’ler, etanolü uzaklaştırmak ve pH’ı 7.4’e geçirmek için pH 7.4’te (100x hacim) 10 mM’lik bir HEPES tamponuna karşı diyalize edilir. Bu işlem sırasında, Şekil 5A’da gösterildiği gibi, literatürdeki iyi çalışılmış füzyon mekanizması ile uyumlu olarak, bir miktar LNP füzyonu ve biraz daha büyük bir boyuta büyüme vardır33. Genel olarak, CIJ ve MIVM karıştırıcılar kullanılarak yapılan LNP’ler 100 nm’den azken, pipet karıştırma kullanılarak yapılan LNP’ler 140 nm civarındadır. Şekil 5B’de gösterildiği gibi, bu formülasyonlar için zeta potansiyelleri 10 mV’den azdır, bu da hepsinin pH 7.4’te nötr olduğunu gösterir. Ek olarak, hepsi %>95 gibi yüksek kapsülleme verimliliği gösterir (Şekil 5C). Böylece, optimum fizikokimyasal özelliklere sahip LNP’ler, türbülanslı karıştırıcı teknolojileri kullanılarak kolayca üretilebilir. Bu LNP’lerin performansı, HeLa hücrelerinde in vitro transfeksiyon gerçekleştirilerek değerlendirilir. Luciferaz bazlı in vitro transfeksiyon test protokolü, önceki bir yayındanuyarlanmıştır 34. Şekil 6A, Tablo 1000’te özetlenen üç formülasyon için 5 hücre başına lüminesansı (RLU) çizer. Lipofectamine 3000 pozitif kontrol olarak kullanılır. Lipofektamin 3000’in genellikle DNA formülasyonları için kullanıldığına dikkat etmek önemlidir; Ancak, bu deneylerde yeterli bir kontrol olarak çalıştı. 2 jetli CIJ ve 4 jetli MIVM karıştırıcılar kullanılarak yapılan LNP’ler, pipet karıştırma kullanılarak yapılan LNP’lerden çok daha iyi transfekt eder. LNP başına daha fazla yük kapasitesi nedeniyle daha büyük parçacıkların küçük parçacıklardan daha iyi transfekte etmesi beklense de, burada pipet karıştırma kullanılarak yapılan LNP’ler daha az etkili bir şekilde transfekte eder. Bu açıkça, CIJ teknolojileri ile yapılan LNP’lerin yapılarında, pipet karıştırma ile yapılan LNP’lere kıyasla önemli bir fark olduğunu ima eder. CIJ ve MIVM karıştırıcıları ile yapılan LNP’lerin transfeksiyon verimleri temelde aynıdır. Lipofectamine 3000 en düşük transfeksiyon verimliliğini gösterir. Şekil 6B, sodyum resazurin tuzu35’e dayalı bir hücre canlılığı testi kullanarak HeLa hücreleri üzerindeki in vitro LNP toksisitesini değerlendirir. Tüm formülasyonlar, herhangi bir nanopartikül işlemine sahip olmayan kontrole karşı canlı hücrelerin yüzdesi olarak çizildiğinde yüksek seviyelerde hücre canlılığı ile sergilenen düşük sitotoksisite gösterir. Şekil 1: LNP’leri üretmek için karıştırma yöntemleri. (A) Laboratuvarda düzenli olarak kullanılan şeffaf bir karıştırıcı ve monte edilmiş bir Delrin karıştırıcı düzeneğinin fotoğrafını gösteren iki jet sınırlı çarpma jet karıştırıcı (CIJ). (B) Şeffaf bir karıştırıcının ve monte edilmiş bir paslanmaz çelik ve Delrin karıştırıcı kurulumunun bir fotoğrafını gösteren dört jetli mikro çoklu girişli girdap karıştırıcı (μMIVM). Şeffaf mikser için giriş akışları, karıştırma geometrisinin daha iyi görselleştirilmesi için mikserin yanlarına taşınırken, pratik mikserde giriş akışları üstten girer. Hem CIJ hem de μMIVM, akışların türbülanslı rejimde olduğu yeterli sıvı hızıyla çalışır ve karıştırma, 1 μm’den daha küçük Kolmogorov mikro ölçekleri üretir, bu da ~ 1.5 ms’de aşırı doygunluğa ulaşılmasını sağlar. (C) Sulu ve etanolik çözeltileri karıştırarak küçük hacimlerde LNP dispersiyonları hazırlamak için yaygın olarak kullanılan pipet karıştırma kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: μMIVM ve karıştırma standının genişletilmiş görünümü. (A) Şırıngaların eşit ve hızlı bir şekilde bastırılmasını kolaylaştıran mikser standının altına cam şırıngalarla μMIVM monte edilmiştir. Bu rakam Markwalter ve ark.29’dan alınmıştır. (B) İç bileşenleri gösteren demonte μMIVM. Bu karıştırma geometrisi, giriş akışlarının yanal silindirik yüzeyden değil, üst diskten girmesi dışında, Şekil 1B’deki şeffaf karıştırıcı ile aynıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Türbülanslı bir karıştırıcıda artan Reynolds sayısı, LNP hidrodinamik çapını plato kritik bir Reynolds sayısına kadar azaltır. (A) Akış hacimsel akış hızlarını ayarlayarak türbülanslı karıştırıcıdaki Reynolds sayısını kontrol etmek için kullanılan şırınga pompasının ve μMIVM kurulumunun şematik gösterimi. (B) MIVM’deki Reynolds sayısına karşı LNP hidrodinamik çapı. Reynolds sayısının ve türbülanslı enerji dağılımının arttırılması, karıştırmayı iyileştirir ve daha homojen karışıma, aşırı doygunluğa ve parçacıkların büyümesine yol açar. Kritik Reynolds sayısının üzerinde, LNP boyutları, Da<<1 koşulu nedeniyle artan akış hızlarıyla sabit kalır, yani çözücü/antiçözücü difüzyon süresi, NP montaj süresinden daha kısadır. Verilen akış hızları, dört akışın tümünün toplam akış hızlarıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Farklı iyonlaşabilir lipidlerle üretilen LNP’lerin kolloidal özellikleri. (A) İki farklı iyonlaşabilir lipid ile üretilen LNP’lerin hidrodinamik çapları ve zeta potansiyelleri: ALC-0315 ve MC3. LNP oluşumundan sonra söndürme banyosunda pH 5’te ölçümler yapılır. İyonlaşabilir lipidlerin görünür pKa’sındaki farklılıklar, LNP’lerin kolloidal özelliklerini etkiler. (B) Her iki LNP’nin kapsülleme verimliliği ölçümleri (n = 3, hata çubukları bir standart sapmayı temsil eder). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: MC3 iyonlaşabilir lipid kullanılarak lusiferaz mRNA’yı kapsülleyen farklı karıştırıcılarla üretilen LNP’lerin kolloidal özellikleri. (A) 2 jetli, 4 jetli ve pipetli karıştırıcılarla üretilen LNP’lerin hidrodinamik çapları. Ölçümler hem LNP oluşumundan sonra (sol taraf) hem de diyalizden sonra nötr bir HEPES tamponuna (sağ taraf) söndürme banyosunun asidik koşulları altında gerçekleştirilir. LNP boyutu, iyonize olabilen lipidin deiyonizasyonu nedeniyle pH nötralizasyonu sırasında büyür ve LNP füzyonuna ve büyümesine yol açar. Lipid-PEG stabilizatörü, mikron boyutunda çökeltiler oluşmadan önce bu partikül birleşme büyümesini durdurur. (B) 10 mM HEPES, pH 7.4 koşulunda diyalize edilmiş LNP’lerde yüzey yükü ölçümleri (ζ-potansiyel olarak). Tüm LNP’ler 2 mV ile 0 mV arasındadır, bu da bu parçacık yüzeylerinin nötr olduğunu ve yalnızca neredeyse tespit edilemeyen miktarda katyonik yüke sahip olduğunu gösterir. (C) LNP’lerin diyalizinden sonra kapsülleme verimliliği ölçümleri (n = 3, hata çubukları bir standart sapmayı temsil eder). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: HeLa hücrelerinin hazırlanmış LNP’lerle transfeksiyonu. (A) Lusiferin ile muameleden sonra eksprese edilen lusiferaz enziminin lüminesansı. (B) LNP’lerle inkübasyondan sonra HeLa hücrelerinin canlılığı. Hücreler, bir resazurin metabolik tahlili ile gösterildiği gibi, canlılıkta istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik göstermez (n = 4, hata çubukları bir standart sapmayı temsil eder). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Akış(lar) /Söndürme banyosu Parça Formülasyon Stok Hacim Şırınga 1 -Etanol akışı(6 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3) mol 50 mg / mL 0,5 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 2 -Sulu akış(0.3 mg/mL RNA) Maya RNA’sı N/P 6 10 mg / mL 0,5 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Söndürme banyosu Asetat Tamponu 10 mM, pH 4 100 mM, pH 4 4 mL Tablo 1: Bir CIJ karıştırıcı tarafından üretilen standart patisiran LNP Formülasyonu. Maya RNA’sı bu protokol için model RNA olarak kullanılır. Tüm çözeltiler moleküler olarak çözülür ve şırıngalara yüklenmeden önce iyice karıştırılır. Akış(lar) /Söndürme banyosu Parça Formülasyon Stok Hacim Şırınga 1 -Etanol akışı(6 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3) mol 50 mg / mL 0,5 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 2 -Sulu akış(0.3 mg/mL RNA) Maya RNA’sı N/P 6 10 mg / mL 0,5 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Şırınga 3 -Etanol akışı(6 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3) mol 50 mg / mL 0,5 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 4 -Sulu akış(0.3 mg/mL RNA) Maya RNA’sı N/P 6 10 mg / mL 0,5 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Söndürme banyosu Asetat Tamponu 10 mM, pH 4 100 mM, pH 4 8 mL Tablo 2: Bir MIVM karıştırıcı tarafından üretilen standart patisiran LNP Formülasyonu. Bir MIVM karıştırıcı dört akış kullanır – iki çözücü ve iki çözücü. Eşit olmayan momentuma sahip akışlar kullanılabilir; Ancak, bu protokol için eşit momentuma sahip akışlar seçilir. Akış(lar) /Söndürme banyosu Parça Formülasyon Stok Hacim Şırınga 1 -Etanol akışı(6 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3) mol 50 mg / mL 20 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 2 -Sulu akış(0.3 mg/mL RNA) Maya RNA’sı N/P 6 10 mg / mL 20 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Şırınga 3 -Etanol akışı(6 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3) mol 50 mg / mL 20 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 4 -Sulu akış(0.3 mg/mL RNA) Maya RNA’sı N/P 6 10 mg / mL 20 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Söndürme banyosu(Toplama zamanı= 30 sn) HEPES Tamponu 10 mM, pH 7.5 1 m, pH 7.5 320 mL Tablo 3: Bir şırınga pompası tarafından tahrik edilen bir MIVM karıştırıcı tarafından üretilen LNP Formülasyonu. DODMA, model RNA olarak maya RNA’sı ile birlikte iyonlaşabilir bir lipid olarak kullanılır. Bu protokol için 40 mL/dk ile çalıştırılan örnek bir program seçilmiştir. Akış(lar) /Söndürme banyosu Parça Formülasyon Stok Hacim Şırınga 1 -Etanol akışı(12 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3 veya ALC0315) mol 50 mg / mL 0,5 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 2 -Sulu akış(0.6 mg/mL RNA) Maya RNA’sı N/P 6 10 mg / mL 0,5 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 5 100 mM, pH 5 Söndürme banyosu Asetat Tamponu 10 mM, pH 5 100 mM, pH 5 9 mL Tablo 4: Bir CIJ karıştırıcı tarafından üretilen iki farklı iyonlaşabilir lipidden LNP Formülasyonları. Formülasyonlar ALC-0315 veya MC3’ten yapılırken, diğer tüm bileşenler aynı tutulur. Akış(lar) /Söndürme banyosu Parça Formülasyon Stok Hacim Şırınga 1 -Etanol akışı(6 mg/mL toplam lipid) İyonize olabilen lipid (MC3) mol 50 mg / mL 0,5 mL Zwitterion lipidi (DSPC) mol 5 mg / mL Kolesterol ,5 mol 5 mg / mL Pegile lipid (DMG-PEG2000) %1,5 mol 4 mg / mL Şırınga 2 -Sulu akış(0.3 mg/mL RNA) FLuc mRNA N/P 6 1 mg / mL 0,5 mL Asetat Tamponu 20 mM, pH 4 100 mM, pH 4 Söndürme banyosu Asetat Tamponu 10 mM, pH 4 100 mM, pH 4 4 mL Tablo 5: Bir CIJ karıştırıcı tarafından üretilen standart patisiran LNP Formülasyonu. Bir lusiferaz proteinini eksprese eden FLuc mRNA, bir biyolüminesans testi kullanılarak gen ekspresyonunu ölçmek için kullanılır. Ek Dosya 1: CIJ ve MIVM Mikser Tedarikçileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Nükleik asit polimerleri içeren LNP’lerin iki kapalı çarpma jet türbülanslı karıştırıcı kullanılarak sentezi sunulmuştur. Uygun hızlarda yürütüldüğünde, CIJ türbülanslı karıştırıcılar, karıştırma zaman ölçeğinin LNP montaj süresinden daha kısa olmasını sağlayarak, dar boyut dağılımlarına sahip küçük LNP’ler oluşturmak için homojen aşırı doygunluk koşulları üretir²¹. Sonuç olarak, farklı türbülanslı karıştırıcı geometrileri (2-jet CIJ ve 4-jet MIVM karıştırıcı) kullanılarak aynı kimya ile yapılan LNP’ler, benzer fizikokimyasal özellikler sergiler ve iyi transfeksiyon verimlilikleri gösterir (Şekil 5 ve Şekil 6). Buna karşılık, daha zayıf karıştırma üreten pipetleme kullanılarak yapılan LNP’ler, daha düşük transfeksiyon verimliliğine sahip daha büyük ve daha fazla polidispers LNP’ler (Şekil 5A) ile sonuçlanır. Karıştırma ve birleştirme kinetiğinin LNP işlemede önemli bir rol oynadığı uzun zamandır anlaşılmıştır; Cullis ve ark. etanol ve tamponun hızlı konvektif-difüzyonlu karışımının dar bir boyut dağılımına sahip küçük parçacıkların oluşumuna yol açtığını, yavaş difüzyonlu karışımın ise geniş boyut dağılımlarına sahip daha büyük parçacıklara yol açtığını belirtmiştir⁹. CIJ türbülanslı karıştırıcılarda karıştırma zaman ölçeği, akışların karıştırıcıya²⁷ giriş akış hızlarıyla orantılı olarak azalır. Bu, eylemsizlik ve viskoz kuvvetler arasındaki oranı ölçen boyutsuz Reynolds sayısı (Re) ile ölçülür. CIJ ve MIVM’nin karıştırma odalarının içindeki türbülans, yeterince yüksek Re’de meydana gelir, öyle ki türbülanslı girdap gerilmesi, difüzyon yoluyla hızlı çözücü/çözücü önleyici karışımı üreten küçük uzunluk ölçekleri ile sonuçlanır. Türbülanslı uzunluk ölçeği, karıştırma cihazının spesifik geometrisine değil, Re’ye bağlıdır. Bu nedenle CIJ veya MIVM aynı LNP parçacıklarını üretir ve bu nedenle çeşitli boyutlardaki MIVM karıştırıcıları aynı NP boyutlarını²⁷ yapar. Yüksek giriş hızlarına karşılık gelen yüksek Re’de, LNP’ler partiden partiye varyasyonlar olmadan tekrarlanabilir şekilde yapılabilir (Şekil 3B).

Bu protokol, türbülanslı CIJ karıştırıcılar kullanılarak farklı fizikokimyasal özelliklere sahip çeşitli mRNA, DNA veya siRNA LNP’lerin formülasyonunu sağlar. Bileşim ve konsantrasyonlarda çok yönlülüğe izin vermenin yanı sıra, bu teknik, formülasyonları tezgah satışında (birkaç miligram) hızlı bir şekilde taramak ve kurşun formülasyonlarını 5 L / dak³⁶ üretim hızlarında daha büyük endüstriyel parti boyutlarına ölçeklendirmek için açık bir yol sağlar. Bu, toplu karıştırma ve mikroakışkanlar dahil olmak üzere diğer birçok teknik için büyük bir engel olmuştur. Örneğin, toplu işleme teknikleri, LNP’leri birkaç mililitrelik ölçeklerde bile tekrarlanabilir bir şekilde tutarlı bir şekilde üretemez. Mikroakışkan teknikler, tek tip ve tekrarlanabilir LNP’lerin üretimini sağlamak için toplu karıştırma tekniklerine göre önemli bir gelişme sağlar; Ancak, sadece^{miligram 29} aralığındadırlar. Giriş bölümünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, mikroakışkan cihazların paralelleştirilmesi, üretim ölçeklerine ölçeklendirme girişimi sağlar, ancak kirlenme sorununu ortadan kaldırmaz ve sınırlı çarpma jet teknolojisine dayalı karıştırıcılar kadar başarılı bir şekilde ölçeklendirilemez.

Bu avantajların yanı sıra, CIJ karıştırıcılar, hedefleme yetenekleri sergileyen veya gen düzenlemesi yapan yeni nesil LNP’lerin üretiminde etkili olacaktır. Mevcut LNP formülasyonları, benzer difüzyonlara sahip lipitlere ve nükleik asitlere sahiptir ve bu nedenle, tezgah ölçeğinde biraz zayıf karıştırma ile bile yapılabilirler. Bununla birlikte, gen düzenleme yaklaşımları, bir CAS9 proteinini kodlamak için küçük kılavuz RNA molekülleri ve büyük mRNA transkriptleri gibi çok farklı moleküler ağırlıklara sahip nükleik asit türlerinin kapsüllenmesini gerektirebilir³⁷. Bu farklı türlerin çok farklı difüzyon zaman ölçekleri, stokiyometrik oranlarda tek tip kapsüllemeyi zorlaştırır. Bu homojen kapsülleme sorunu, karıştırma verimliliği zayıfladıkça daha belirgin hale gelir. Benzer şekilde, hepatik olmayan hücrelerin hedeflenmesi, güçlü bir şekilde bağlanmış yavaş yayılan stabilizatörlerin (hedefleme ligandlarına sahip büyük moleküler ağırlıklı blok kopolimerler gibi) dahil edilmesini gerektirebilir. 14 kDa’ya kadar olan hedefleme ligandları, nanopartikül montajından önce kopolimerleri bloke etmek için konjuge edilebilir, bu da CIJ karıştırma³⁸ kullanılarak NP’lere homojen bir şekilde dahil edilmelerini sağlar. CIJ türbülanslı karıştırıcılar, farklı yayılımlara sahip bileşenlerle yapılan LNP’leri üretmek için kullanışlı araçlardır.

CIJ türbülanslı karıştırıcılar, LNP’leri formüle etmek için diğer karıştırıcılara göre çeşitli avantajlar gösterse de, her bir geometri ile ilişkili sınırlamalara dikkat etmek önemlidir. 2 jetli CIJ karıştırıcı, haznede homojen türbülanslı mikro karıştırma elde etmek için her iki giriş akışının da (etanol ve su) eşit momentuma (%10-30 dahilinde) sahip olmasını gerektirir. Çıkış akışının 50:50 çözücü/antiçözücü içermesi, çökelmenin meydana geldiği karıştırma boşluğundaki aşırı doygunluk seviyesini sınırlar²⁹. Bu dezavantaj, karıştırma odasında yüksek aşırı doygunluk koşullarını elde etmek için eşit olmayan momente sahip dört jet kullanabildiği için 4 jetli MIVM karıştırıcı tarafından ele alınır. Ek olarak, her iki karıştırıcının da toplam kütlenin miligram mertebesinde olması gerekir, bu da onları birçok farklı LNP formülasyonunun yüksek verimli taraması için ideal olmayan bir seçim haline getirir. Basit LNP formülasyonları için, tarama en iyi şekilde mikrogram ölçeklerinde mikroakışkanlar veya pipetleme stratejileri ile yapılabilir ve daha sonra birkaç kurşun formülasyonu tanımlandığında sınırlı çarpma jet teknolojisine aktarılabilir. Mikserlerdeki ölü hacimleri de dikkate almak çok önemlidir. İki jet mikser olan CIJ’de tutma hacimleri 50-100 mikrolitredir. Bu malzeme miktarı, prosesten geri kazanım hesaplanırken söndürme banyosunda yakalanan miktardan çıkarılmalıdır. Bu kayıplar, büyük ölçeklerde çalışırken önemsizdir, ancak burada gösterildiği gibi toplam 5 mL’lik hacimler üretildiğinde %10’luk kayıplara neden olur. Çarpan jet türbülanslı karıştırıcılar, FDA onaylı iki COVID-19 aşısının kanıtladığı gibi, GMP ölçeğinde LNP’ler üretmek için değerli bir araçtır.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

BKW’ye NSF Bursu (DGA1148900), Tessera Therapeutics Inc., Bill ve Melinda Gates Vakfı (BMGF, sözleşme numaraları OPP1150755 ve INV-041182) ve FDA’dan 75F40122C00186 ödülü altında destek.

Materials

18:0 PC (DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365P	Helper lipid
21 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlide Needle	BD	305167
96 Well Black Wall Black Bottom Plate	Fisher Scientific	07-000-135
96 Well White/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165306
Acetic Acid, Glacial	Fisher Scientific	A38-212
ALC-0315	Avanti Polar Lipids	890900	Ionizable lipid
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 15 mL	Millipore Sigma	UFC910024
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO, 4 mL	Millipore Sigma	UFC810096
Bright-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2620
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
CleanCap FLuc mRNA (5 moU)	Trilink Biotechnologies	L-7202
Confined Impinging Jets Mixer	Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders and the Helix Biotech system is Nova BT. Review text for new mixer validation
D-Lin-MC3-DMA	MedChemExpress	HY-112251	Ionizable lipid
DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11995065
DMG-PEG 2000	Avanti Polar Lipids	880151P	PEG-lipid
DODMA	Avanti Polar Lipids	890899P	Ionizable lipid
Ethanol 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-70C
Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, certified, United States	Thermo Fisher Scientific	16000044
HeLa	ATCC	CCL-2
HEPES, free acid	IBI Scientific	IB01130
HSW HENKE-JECT two-part 1 mL Luer	Henke Sass Wolf	4010.200V0
HSW HENKE-JECT two-part 5 mL (6 mL) Luer Lock	Henke Sass Wolf	4050.X00V0
Idex 1648 ETFE tubing ” OD 0.093” ID	Idex Health & Science	1648
Idex P-678 ¼”-28 to Luer fitting	Idex Health & Science	P-678
Idex P-940 ferrule for ETFE tubing	Idex Health & Science	P-940
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads. Idex parts are also available through VWR and many other suppliers
Mixer stand	Holland Applied Technologies	N/A	See Markwalter & Prud'homme for design.²⁶ Contact Holland for Purchase
Multi-Inlet Vortex Mixer	Holland Applied Technologies and Diamond Tool and Die (DTD)	N/A	Contact Holland or DTD for custom orders. Review text for new mixer validation
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk – consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Outlet ferrule – CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet fitting – CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet fitting – MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing – CIJ	Idex Health & Science	1517	Use a tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrude into mixing chamber
Outlet tubing – MIVM	N/A	N/A	Fit to ferrule ID.
PBS – Phosphate-Buffered Saline (10x) pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher Scientific	AM9624
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
PHD 2000 Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	N/A
Plastic two-piece syringe 1 mL	Thermo Fisher Scientific	S7510-1
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Quant-it RiboGreen RNA Assay Kit and RiboGreen RNA Reagent, RediPlate 96 RiboGreen RNA Quantitation Kit	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	R11491
Resazurin, Sodium Salt	Thermo Fisher Scientific	R12204
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7000TS1
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 100 mL	SGE	100MR-LL-GT
SGE Gas Tight Syringes, Luer Lock, 50 mL	SGE	50MR-LL-GT
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 20 K MWCO	Thermo Fisher Scientific	66012
Sodium Acetate	Millipore Sigma	32319-500G-R
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S320-500
Sucrose	Millipore Sigma	S7903-1KG
Syringe Filters, Sterile	Genesse Scientific	25-243
Triton X-100	Millipore Sigma	9036-19-5
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
Water, Endotoxin Free	Quality Biological	118-325-131	RNAse and DNAse free
Yeast RNA (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	AM7118

Riferimenti

Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
Dowdy, S. F., Setten, R. L., Cui, X. -. S., Jadhav, S. G. Delivery of RNA therapeutics: The great endosomal escape. Nucleic Acid Ther. 32 (5), 361-368 (2022).
Eygeris, Y., Patel, S., Jozic, A., Sahay, G. Deconvoluting lipid nanoparticle structure for messenger RNA delivery. Nano Lett. 20 (6), 4543-4549 (2020).
Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─from liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
Buck, J., Grossen, P., Cullis, P. R., Huwyler, J., Witzigmann, D. Lipid-based DNA therapeutics: Hallmarks of non-viral gene delivery. ACS Nano. 13 (4), 3754-3782 (2019).
Semple, S. C., et al. Rational design of cationic lipids for siRNA delivery. Nat Biotechnol. 28 (2), 172-176 (2010).
Lam, K., et al. Unsaturated, trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), 2209624 (2023).
Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Ther. 28 (3), 146-157 (2018).
Jürgens, D. C., et al. Lab-scale siRNA and mRNA LNP manufacturing by various microfluidic mixing techniques – an evaluation of particle properties and efficiency. OpenNano. 12, 100161 (2023).
Wang, X., et al. Preparation of selective organ-targeting (sort) lipid nanoparticles (LNPs) using multiple technical methods for tissue-specific mRNA delivery. Nat Protoc. 18 (1), 265-291 (2023).
Yanez Arteta, M., et al. Successful reprogramming of cellular protein production through mRNA delivered by functionalized lipid nanoparticles. Proc Natl Acad Sci. 115 (15), E3351-E3360 (2018).
Eygeris, Y., Gupta, M., Kim, J., Sahay, G. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2022).
Shepherd, S. J., et al. Scalable mRNA and siRNA lipid nanoparticle production using a parallelized microfluidic device. Nano Lett. 21 (13), 5671-5680 (2021).
Leung, A. K. K., Tam, Y. Y. C., Chen, S., Hafez, I. M., Cullis, P. R. Microfluidic mixing: A general method for encapsulating macromolecules in lipid nanoparticle systems. J Phys Chem B. 119 (28), 8698-8706 (2015).
Prakash, G., et al. Microfluidic fabrication of lipid nanoparticles for the delivery of nucleic acids. Adv Drug Deliv Rev. 184, 114197 (2022).
Carvalho, B. G., Ceccato, B. T., Michelon, M., Han, S. W., De La Torre, L. G. Advanced microfluidic technologies for lipid nano-microsystems from synthesis to biological application. Pharmaceutics. 14 (1), 141 (2022).
Webb, C., et al. Using microfluidics for scalable manufacturing of nanomedicines from bench to GMP: A case study using protein-loaded liposomes. Int J Pharm. 582, 119266 (2020).
Warne, N., et al. Delivering 3 billion doses of comirnaty in 2021. Nat Biotechnol. 41 (2), 183-188 (2023).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Flash nanoprecipitation of organic actives and block copolymers using a confined impinging jets mixer. Aust J Chem. 56 (10), 1021-1024 (2003).
Hogarth, C., et al. Evaluating the impact of systematic hydrophobic modification of model drugs on the control, stability and loading of lipid-based nanoparticles. J Mater Chem B. 9 (48), 9874-9884 (2021).
Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 1, e37 (2012).
D’addio, S. M., Prud’homme, R. K. Controlling drug nanoparticle formation by rapid precipitation. Adv Drug Deliv Rev. 63 (6), 417-426 (2011).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Mechanism for rapid self-assembly of block copolymer nanoparticles. Phys Rev Lett. 91 (11), 118302 (2003).
Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 101 (10), 4018-4023 (2012).
Markwalter, C. E., Prud’homme, R. K. Design of a small-scale multi-inlet vortex mixer for scalable nanoparticle production and application to the encapsulation of biologics by inverse flash nanoprecipitation. J Pharm Sci. 107 (9), 2465-2471 (2018).
Johnson, B. K., Prud’homme, R. K. Chemical processing and micromixing in confined impinging jets. AIChE J. 49, 2264-2282 (2003).
Markwalter, C. E., Pagels, R. F., Wilson, B. K., Ristroph, K. D., Prud’homme, R. K. Flash nanoprecipitation for the encapsulation of hydrophobic and hydrophilic compounds in polymeric nanoparticles. J Vis Exp. (143), e58757 (2019).
Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and characterizing lipid nanoparticles for gene delivery using a microfluidic mixing platform. J Vis Exp. 168, e62226 (2021).
Bizmark, N., et al. Ribogreen fluorescent assay kinetics to measure ribonucleic acid loading into lipid nanoparticle carriers. Adv Mater Interfaces. 11 (17), 2301083 (2024).
Zhang, C., et al. Modification of lipid-based nanoparticles: An efficient delivery system for nucleic acid-based immunotherapy. Molecules. 27 (6), 1943 (2022).
Kulkarni, J. A., et al. Fusion-dependent formation of lipid nanoparticles containing macromolecular payloads. Nanoscale. 11 (18), 9023-9031 (2019).
El-Mayta, R., Padilla, M. S., Billingsley, M. M., Han, X., Mitchell, M. J. Testing the in vitro and in vivo efficiency of mRNA-lipid nanoparticles formulated by microfluidic mixing. J Vis Exp. (191), e64810 (2023).
Scalzo, S., et al. Ionizable lipid nanoparticle-mediated delivery of plasmid DNA in cardiomyocytes. Int J Nanomed. 17, 2865-2881 (2022).
Feng, J., Markwalter, C. E., Tian, C., Armstrong, M., Prud’homme, R. K. Translational formulation of nanoparticle therapeutics from laboratory discovery to clinical scale. J Transl Med. 17 (1), 200 (2019).
Kazemian, P., et al. Lipid-nanoparticle-based delivery of CRISPR/cas9 genome-editing components. Mol Pharm. 19 (6), 1669-1686 (2022).
Pinkerton, N. M. . Polymeric drug delivery vehicles and imaging agents. , (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Subraveti, S. N., Wilson, B. K., Bizmark, N., Liu, J., Prud’homme, R. K. Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers. J. Vis. Exp. (210), e67047, doi:10.3791/67047 (2024).