Сборка органоидов сетчатки с микроглией
Summary
Микроглия является уникальными резидентными иммунными клетками в сетчатке, играющими решающую роль в различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Создание модели совместного культивирования органоидов сетчатки с микроглией может способствовать лучшему пониманию патогенеза и прогресса развития заболеваний сетчатки.
Abstract
Из-за ограниченной доступности сетчатки человека, органоиды сетчатки (РО) являются лучшей моделью для изучения заболеваний сетчатки человека, которые могут выявить механизм развития сетчатки и возникновение заболеваний сетчатки. Микроглия (МГ) — это уникальные резидентные макрофаги в сетчатке глаза и центральной нервной системе (ЦНС), выполняющие важнейшие иммунные функции. Тем не менее, органоиды сетчатки лишены микроглии, так как источником их дифференцировки является желточный мешок. Специфический патогенез микроглии при этих заболеваниях сетчатки остается неясным; Таким образом, создание модели органоида сетчатки, инкорпорированной в микроглию, оказывается необходимым. Здесь мы успешно построили совместно культивируемую модель органоидов сетчатки с микроглией, полученной из стволовых клеток человека. В этой статье мы дифференцировали микроглию, а затем совместно культивировали с органоидами сетчатки на ранней стадии. Поскольку эта модель включает в себя иммунные клетки, она обеспечивает оптимизированную платформу для моделирования заболеваний сетчатки и скрининга лекарственных препаратов для содействия углубленным исследованиям патогенеза и лечения заболеваний, связанных с сетчаткой и ЦНС.
Introduction
Дифференцировка стволовых клеток человека в трехмерные (3D) органоиды сетчатки представляет собой многообещающую модель in vitro для моделирования сетчатки1. Он содержит различные типы клеток сетчатки, включая фоторецепторы, ганглиозные клетки сетчатки, биполярные клетки, клетки Мюллера, горизонтальные клетки и астроциты2. Эта модель позволяет имитировать и изучать как механизмы развития сетчатки, так и патогенез заболеваний сетчатки. Однако, благодаря методу направленной дифференцировки, органоиды сетчатки были получены из нейроэктодермы3, в то время как многие другие типы клеток происходят из других зародышевых слоев, таких как микроглия из желточного мешка и периваскулярные клетки из мезодермы 4,5,6.
В настоящее время доказано, что многие заболевания сетчатки, такие как пигментный ретинит7, глаукома8 и ретинобластома9, тесно связаны с микроглией в сетчатке. Однако из-за отсутствия надлежащих исследовательских моделей конкретные механизмы, иллюстрирующие взаимосвязь между микроглией и этими заболеваниями, до сих пор остаются неясными. В то время как мыши послужили благоприятной моделью для изучения заболеваний сетчатки, недавние исследования выявили значительные различия между мышиной и человеческой микроглией с точки зрения продолжительности жизни, скорости пролиферации и отсутствия гомологичныхгенов человека. Эти результаты свидетельствуют о том, что выводы, сделанные на основе мышиных моделей, могут быть не совсем надежными, что подчеркивает важность создания органоидов сетчатки человека, содержащих микроглию.
За последние несколько десятилетий были разработаны различные методы 3D-дифференцировки органоидовсетчатки12,13. Чтобы облегчить кокультуральную операцию микроглии в органоидах сетчатки, мы выбрали метод дифференцировки, предполагающий переход от адгезивной культуры к суспензионной. Такой подход успешно позволяет встраивать микроглию в органоиды сетчатки, поддерживая их в течение как минимум 60 дней14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Из-за ограниченной доступности сетчатки глаза человека наше нынешнее понимание воспалительных реакций сетчатки почти основано на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, были дифференцированы органоиды сетчатки. Разработка моделей органоидов сетчатки является активной ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (82101145) и Пекинским фондом естественных наук (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
Riferimenti
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- O’koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
- Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
- Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
- Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
- Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).
