השתלת מכשירים אופטואלקטרוניים בחוט השדרה המכרסם
Summary
פרוטוקול זה מפרט הליך כירורגי לביצוע ניתוחי חוט שדרה ולהשתלה ואבטחה של שוק אופטי מעל חוט השדרה במכרסמים.
Abstract
נוירומודולציה יכולה לספק יישומים אבחוניים, מודולטוריים וטיפוליים. בעוד עבודה נרחבת נעשתה במוח, אפנון של חוט השדרה נותר יחסית לא נחקר. רקמת חוט השדרה העדינה והניידת מטבעה מטילה אילוצים שהופכים את ההשתלה המדויקת של בדיקות עצביות למאתגרת. למרות ההתקדמות האחרונה במכשירי נוירומודולציה, במיוחד ביואלקטרוניקה גמישה, ההזדמנויות להרחיב את השימוש בהם בחוט השדרה הוגבלו על ידי המורכבות הכירורגית של השתלת מכשירים. כאן, אנו מספקים סדרה של פרוטוקולים כירורגיים המותאמים במיוחד להשתלת מכשיר אופטואלקטרוני בהתאמה אישית המתממשק עם חוט השדרה במכרסמים. השלבים למיקום ועיגון שוק אופטי על מקטע מסוים של חוט השדרה באמצעות שתי שיטות השתלה כירורגיות שונות מפורטים כאן. שיטות אלה מותאמות למגוון רחב של מכשירים ויישומים, אשר עשויים לדרוש או לא לדרוש מגע ישיר עם חוט השדרה לצורך גירוי אופטי. כדי להבהיר את המתודולוגיה, האנטומיה של החוליות מוזכרת תחילה כדי לזהות ציוני דרך בולטים לפני ביצוע חתך בעור. השלבים הכירורגיים לאבטחת שוק אופטי מעל עמוד השדרה הצווארי במכרסמים מודגמים. לאחר מכן מתוארים נהלים לאבטחת המכשיר האופטו-אלקטרוני המחובר לשוק האופטי בחלל תת עורי הרחק מחוט השדרה, תוך מזעור מגע ישיר מיותר. מחקרים התנהגותיים שהשוו בין בעלי חיים שקיבלו את השתלים לבין אלה שעברו ניתוחי דמה מצביעים על כך שהשוקיים האופטיים לא השפיעו לרעה על תפקוד הגפיים האחוריות או הקדמיות שבעה ימים לאחר ההשתלה. העבודה הנוכחית מרחיבה את ארגז הכלים של נוירומודולציה לשימוש במחקרים עתידיים שמטרתם לחקור התערבויות שונות בחוט השדרה.
Introduction
חוט השדרה מאפשר מגוון תפקודים חיוניים של מערכת העצבים המרכזית, החל מתיאום התנהגויות מוטוריות ועד ויסות תהליכים הומיאוסטטיים כגון נשימה 1,2. הבהרת תפקידה של רשת המעגלים המתוחכמת על פני חוט השדרה דורשת ממשקים, בין אם לגירוי חשמלי, הקלטה, אספקת תרופות או גירוי אופטי לאזורים ממוקדים 3,4,5,6. למרות שפותחו מכשירים המאפשרים חקירות כאלה 7,8,9,10,11, נדרשות טכניקות כירורגיות מיוחדות להשתלתם הכרונית בחוט השדרה 4. בפרט, חוט השדרה והחוליות הקשורות אליו הגבירו את הרגישות לעיוותים מכניים הנגרמים על ידי תנועות טבעיות כגון הארכה וכיפוף 8,12,13. מאפיינים ייחודיים אלה של חוט השדרה הופכים את זה למאתגר באופן מהותי להבטיח שהגשושיות המושתלות יישארו יציבות, מתפקדות ומאובטחות במקטע מסוים לאורך תקופות זמן ממושכות.
כאן מתואר פרוטוקול כירורגי להחדרה ואבטחה של שוק אופטי במקטע ממוקד של חוט השדרה (איור 1A). מכיוון שהתממשקות עם אזור צוואר הרחם בפרט הוכחה כמציבה אתגרים ייחודיים9, שלבי ההשתלה מודגמים באופן ספציפי מעל אזור צוואר הרחם C5. יש להניח כי מורכבותו של עמוד השדרה הצווארי נובעת ממיקומו העמוק יותר ומשפע השרירים, מאפיין שאינו בולט לאורך שאר חוט השדרה. בכל מקרה, ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה נועדו להיות ניתנים להתאמה לניתוחים באזורי חוט השדרה השונים. הוראות הדרגתיות מסופקות כדי לאתר ולזהות מקטעי חוט שדרה באמצעות “ציוני דרך” אנטומיים בולטים שניתן לזהות מעל העור (איור 1B). לאחר מכן הפרוטוקול מבהיר שתי טכניקות להשתלה כירורגית: אחת המותאמת לבדיקות הדורשות מגע ישיר עם חוט השדרה, והשנייה לבדיקות שאינן דורשות מגע ישיר. השלבים המתוארים נועדו להיות משוכפלים על ידי כל חוקר עם הכשרה בניתוח הישרדות מכרסמים.
פרוטוקול זה כולל הוראות שלב אחר שלב להשתלת מכשיר אופטואלקטרוני (18 מ”מ x 13 מ”מ) עם שוק אופטי גמיש מחובר מעל רמת צוואר הרחם C5. המכשיר המושתל מאובטח תת עורית קאודלית ל- C5 ומורכב ממחוון דיודה פולטת אור מיקרוסקולית (μLED), המאיר כאשר מתרחש גירוי אופטי של חוט השדרה, ומספק משוב חי של פונקציונליות המכשיר. השפעת השוק האופטי המושתל על התפקוד המוטורי הטבעי הוערכה על מכרסמים שקיבלו שתלים והושוותה למכרסמים שעברו ניתוחי דמה. התוצאות מצביעות על כך שהבדיקות אינן משפיעות לרעה על תפקוד הגפה האחורית והגפיים הקדמיות הטבעיות של בעל החיים שבעה ימים לאחר ההשתלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
נוירומודולציה והתערבויות טיפוליות של חוט השדרה דורשות לעתים קרובות מיקום של בדיקות במקטעים מדויקים וממוקדים 3,4,7,13. בהתחשב בניידות המובנית של חוט השדרה, הגשושית חייבת להיות מאובטחת באופן אמין כדי לאפשר מחקרים כרוניים. בהתבסס על היישום הספציפי, ייתכן שיהיה חשוב לשלוט אם הבדיקה נמצאת במגע פיזי עם חוט השדרה, או אם ניתן להפחית את המגע כדי להפחית את תגובת הרקמה הדלקתית במידת האפשר. לכן, מתוארים צעדים כירורגיים עבור כל אחת משתי השיטות. הפרוטוקול מפרט באופן ספציפי כיצד למקם בדיקה בקטע הצווארי של חוט השדרה ב- C5. עם זאת, באמצעות ציון הדרך המתואר עבור T2 או T10 של חוט השדרה, הבדיקה יכולה להיות ממוקמת באופן דומה במיקום מדויק מעל אזור החזה או המותני על ידי ספירה לאחור של החוליות מ T2 או T10, בהתאמה, ברגע שהם נחשפים. יתר על כן, כדי למזער את הנזק לרקמת חוט השדרה, אבטחנו את גוף המכשיר, שהוא לעתים קרובות גדול ונוקשה יותר בהשוואה לבדיקה המחוברת, בחלל תת עורי הרחק מחוט השדרה.
ישנן כמה נקודות קריטיות להשתלת המכשיר המשולב עם הבדיקה. ראשית, קריטי להחליט על מיקום גוף המכשיר לפני ביסוס הבדיקה. זה מבטיח שהמרחק בין קצה הגשושית לגוף המכשיר מותאם כדי להפחית את המתח על הגשוש, כמו גם להימנע מאורך בדיקה נוסף, אשר יכול, למשל, לגרום לפיתול או תזוזה של הגשוש. בעיקרו של דבר, המטרה היא להבטיח שאורך הבדיקה יהיה דומה למרחק מהחלל התת-עורי שבו ממוקם גוף המכשיר לאזור חוט השדרה הממוקד שבו הגשושית צמנטית. על ידי ביצוע הליכי ניתוח סופניים בהם נבדקים אורכי בדיקה שונים, ניתן לקבוע את הגודל האופטימלי עבור מקטע ממוקד.
כדי לשמור על סטריליות, יש לטפל במכשיר בזהירות כדי למנוע מגע עם השכבה החיצונית של העור במהלך החדרתו לכיס התת עורי. מגע כזה עלול לפגוע בסטריליות המכשיר, מה שעלול להוביל להדבקה לאחר הניתוח. בנוסף, חשוב למזער את כמות הכוח המופעל על המכשיר בעת החזקתו במלקחיים כדי למנוע פגיעה בציפוי שלו, שהוא בדרך כלל שכבה דקה מגנה, מעליבה וסטרילית20,21. הסרת הציפוי עשויה לקצר באופן דרסטי את תוחלת החיים של המכשיר למשל על ידי קיצור המעגל, גרימת התחשמלות לבעל החיים ו/או גרימת תגובה דלקתית בגוף. טיפול במכשיר עם מלקחיים בקצה פלסטיק עשוי לסייע בהפחתת סיבוכים כאלה.
בעת תפירת המכשיר לרקמה רכה, חשוב להימנע מתפירה לרקמת שומן תת עורית. כפי שנצפה בניסויים ראשוניים, שכבות שומן אינן מהוות נקודת עיגון אמינה לתפרים מכיוון שהן נוטות להיקרע. במקום זאת, גוף המכשיר נתפר לשכבת שריר סמוכה בחלל התת עורי באמצעות תפרים שאינם נספגים למיקום קבוע של המכשיר בגוף. מצד שני, כאשר מאבטחים את הגשושית לתהליכים עמוד השדרה, חשוב לוודא שהאתר אליו מאובטחת הגשושית יבש לפני החלת המלט. עצם/בדיקה רטובה מאריכה את זמן הריפוי ועלולה לגרום לכישלון מוחלט של התהליך.
ישנם כמה שיקולים קריטיים הקשורים למכשיר מושתל שיש להתייחס אליהם בזהירות לפני ניתוח ההשתלה. (1) חלקים פעילים חשמלית של המכשיר חייבים להיות עטופים בשכבת פסיבציה מבודדת. כל חסך בשכבה הפסיבית עלול לגרום לכשל תפקודי במכשיר. (2) יש לעקר היטב את המושתל בהתאם לפרוטוקול בעלי החיים של המתקן. (3) הצומת בין המכשיר לבין הגשושיות העצביות או השוקיים המגרים חייב להיווצר היטב. החיבור יעבור לחץ מכני חוזר עקב תנועות קבועות של בעלי חיים. (4) הגשושיות העצביות או שוקי הגירוי המחוברים למכשיר חייבים להיות גמישים ונמתחים מספיק כדי למנוע הצמדה בנקודות שונות.
ניתן להרחיב את הפרוטוקול המתואר למכשירי השתלה במודלים של בעלי חיים בגדלים שונים. לאחר זיהוי ציוני הדרך האנטומיים, ניתן להתאים אישית באופן שיטתי את שיטות הניתוח המתוארות כדי לאבטח כל בדיקה עצבית או שוקיים מגרים במקטעים ממוקדים של חוט השדרה ולהשתיל את מודולי הבקרה הקשורים אליהם. עם זאת, בהתאם ליישום, התקנים שונים יכולים להיות בגדלים, חומרים ועוביים שונים מזה שהושתל במאמר זה; לדוגמה, התקנים המחוברים למודול בקרה חיצוני דורשים שיקולים נוספים. בנוסף, יש לציין כי בעוד פרוטוקול זה מותאם לגירוי אופטוגנטי, יישומים נוירומודולטוריים אחרים, כגון מתן תרופות או גירוי/הקלטה חשמלית, דורשים הליכים כירורגיים שונים במקצת. באופן ספציפי, יישומים אלה זקוקים להשתלה תת-דוראלית כדי להבטיח מגע ישיר עם חוט השדרה מתחת לדורהמאטר 7. עם זאת, עבור אופטוגנטיקה, מגע אינטימי עם הרקמה הוא בדרך כלל מיותר מכיוון שהמכרסם dura mater אינו מעכב באופן משמעותי את חדירת האור, מה שמאפשר למקם מקורות אור אפידורליים10.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.S. ממומנת חלקית על ידי מלגת דוקטורט בת ארבע שנים מאוניברסיטת קולומביה הבריטית. A.M. נתמך חלקית על ידי מלגת בוגר קנדה – תואר שני מהמכון הקנדי לחקר הבריאות (CIHR). ד.ס. מודה על מימון מפרס Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Award. עבודה זו מומנה חלקית על ידי ממשלת קנדה New Frontiers in Research Fund – Transformation (NFRFT-2020-00238). הסכימה באיור 1 נוצרה באמצעות Biorender.com, והמודל התלת-ממדי התקבל באישור sketchfab.com.
Materials
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Alm 3 Point Retractor | Fine Science Tools | 17010-10 | |
| Buprenorphine / Vetergesic | CDMV | 124918 | Manufacturer provides at 0.3 mg/mL but must be diluted to 0.03 mg/kg for use in rats |
| Chlorhexidine 2% Solution | Partnar | PCH-020 | |
| Curved Long Hemostat Forceps | KaamKaaj Tools | 14.5 | Curved Long Hemostat Forceps with A Stainless Steel Ratchet Locking Tweezer |
| CVD Parylene Machine: SCS Labcoter 2 | Specialty Coating Systems | PDS 2010 | |
| Dental Cement – Catalyst | Parkell, Inc | S371 | |
| Dental Cement – Metabond | Parkell, Inc | S398 | |
| Dental Cement – Powder | Parkell, Inc | S396 | |
| Forceps with Replaceable Plastic Tips | Fine Science Tools | 11980-13 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Provided at 5% for induction and 2% for mainentance through precision vaporizer |
| Isopropyl Alcohol 70% | McKesson | 350600 | |
| Lacri-Lube Sterile Eye Ointment | Refresh | ||
| Long Evans Rats | Charles River Laboratories | 6 | |
| Low temperature solder paste | Chip Quik Inc. | 11.38 | |
| Magnets | Radial Magnets, Inc. | 0.53 | Magnet Neodymium Iron Boron (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm) |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PDMS: SYLGARD 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Solder flux | Chip Quik Inc. | 14.25 | |
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Sterile Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments | KWIK-SIL-S | |
| UV Flashlight | Vansky | 19.99 | |
| Wireless Charger | Nilkin | NKT06 | |
| Wireless Charging coil | TDK Corporation | WT202012-15F2-ID |
Riferimenti
- Osseward, P. J., Pfaff, S. L. Cell type and circuit modules in the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 56, 175-184 (2019).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. J Neurosci. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Geng, Y., et al. Advances in optogenetics applications for central nervous system injuries. J Neurotrauma. 40 (13-14), 1297-1316 (2023).
- Montgomery, K. L., Iyer, S. M., Christensen, A. J., Deisseroth, K., Delp, S. L. Beyond the brain: Optogenetic control in the spinal cord and peripheral nervous system. Sci Transl Med. 8 (337), 337rv5 (2016).
- Tan, T., Watts, S. W., Davis, R. P. Drug delivery: Enabling technology for drug discovery and development. iPRECIO Micro infusion pump: Programmable, refillable, and implantable. Front Pharmacol. 2, 44 (2011).
- Suehiro, K., et al. Ecto-domain phosphorylation promotes functional recovery from spinal cord injury. Sci Rep. 4 (1), 4972 (2014).
- Harland, B., et al. A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats. Adv Sci (Weinh). 9 (20), 2105913 (2022).
- Wang, Y., et al. Flexible and fully implantable upconversion device for wireless optogenetic stimulation of the spinal cord in behaving animals. Nanoscale. 12 (4), 2406-2414 (2020).
- Grajales-Reyes, J. G., et al. Surgical implantation of wireless, battery-free optoelectronic epidural implants for optogenetic manipulation of spinal cord circuits in mice. Nat Protoc. 16 (6), 3072-3088 (2021).
- Kathe, C., et al. Wireless closed-loop optogenetics across the entire dorsoventral spinal cord in mice. Nat Biotechnol. 40 (2), 198-208 (2022).
- Hogan, M. K., et al. A wireless spinal stimulation system for ventral activation of the rat cervical spinal cord. Sci Rep. 11 (1), 14900 (2021).
- Lu, C., et al. Flexible and stretchable nanowire-coated fibers for optoelectronic probing of spinal cord circuits. Sci Adv. 3 (3), e1600955 (2017).
- Chen, Y., et al. How is flexible electronics advancing neuroscience research. Biomaterials. 268, 120559 (2021).
- Keomani, E., et al. A murine model of cervical spinal cord injury to study post-lesional respiratory neuroplasticity. J Vis Exp. (87), e51235 (2014).
- Chaterji, S., Barik, A., Sathyamurthy, A. Intraspinal injection of adeno-associated viruses into the adult mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (3), 100786 (2021).
- Agrawal, D. R., et al. Conformal phased surfaces for wireless powering of bioelectronic microdevices. Nat Biomed Eng. 1 (3), 0043 (2017).
- Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proc Natl Acad Sci. 113 (50), E8169-E8177 (2016).
- Manoufali, M., Bialkowski, K., Mohammed, B., Abbosh, A. Wireless power link based on inductive coupling for brain implantable medical devices. IEEE Antennas and Wirel Propaga Lett. 17 (1), 160-163 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. J Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Yang, Y., et al. Preparation and use of wireless reprogrammable multilateral optogenetic devices for behavioral neuroscience. Nat Protoc. 17 (4), 1073-1096 (2022).
- Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nat Neurosci. 24 (7), 1035-1045 (2021).
.