Хирургическая модель одноступенчатых тканеинженерных уротелиальных трубок у минипигов
Summary
Тканеинженерные имплантаты для реконструктивной хирургии редко выходят за рамки доклинических испытаний из-за трудоемкого культивирования ex vivo , которое включает в себя сложные и дорогостоящие компоненты каркаса. Здесь мы представляем одноэтапную процедуру, предназначенную для отведения мочи с помощью доступного трубчатого каркаса на основе коллагена, содержащего аутологичные микротрансплантаты.
Abstract
Реконструктивные операции часто осложняются нехваткой ткани для трансплантации. При лечении урогенитальных мальформаций традиционным решением является забор ткани желудочно-кишечного тракта для неортотопической реконструкции из-за ее изобилия для восстановления нормальной функции у пациента. Клинические исходы после перестройки нативных тканей в организме часто связаны со значительной заболеваемостью; Таким образом, тканевая инженерия обладает определенным потенциалом в этой области хирургии. Несмотря на значительные достижения, тканеинженерные каркасы до сих пор не стали действительной альтернативой хирургическому лечению, в основном из-за дорогостоящих и сложных требований к материалам, производству и имплантации. В этом протоколе мы представляем простой и доступный трубчатый каркас на основе коллагена, встроенный в аутологичные органоспецифические тканевые частицы, разработанный как канал для отведения мочи. Каркас создается во время первичной хирургической процедуры, состоит из общедоступных хирургических материалов и требует обычных хирургических навыков. Во-вторых, протокол описывает животную модель, предназначенную для оценки краткосрочных результатов in vivo после имплантации с возможностью внесения дополнительных изменений в процедуру. Данная публикация призвана продемонстрировать процедуру шаг за шагом, с особым вниманием к использованию аутологичной ткани и трубчатой формы.
Introduction
При пороках развития мочеполовой системы может потребоваться реконструктивная хирургия для восстановления функциональной анатомии, часто по жизненно важным показаниям 1,2. Традиционные хирургические подходы используют нативные ткани из других систем органов (таких как желудочно-кишечный тракт) для реконструкции деформированных или отсутствующих органов; Однако часто с риском развития тяжелых послеоперационных осложнений 3,4. В случае отведения мочи у пациентов с нейрогенной дисфункцией мочевого пузыря, нуждающихся в длительной катетеризации, для создания мочевого каналачасто используется аппендикс или измененные сегменты тонкой кишки 5,6. Тканевая инженерия предлагает альтернативную ткань для трансплантации, которая может быть адаптирована в соответствии с особенностями органа, тем самым минимизируя послеоперационную заболеваемость пациентов 7,8. В то время как скаффолды различных видов могут быть имплантированы сами по себе, было показано, что дополнительная клеточная обработка скаффолда, предпочтительно с помощью аутологичных клеток, улучшает регенеративные результаты после имплантации 9,10,11,12,13,14. Тем не менее, тканеинженерные каркасы часто состоят из сложных и дорогостоящих компонентов, а во-вторых, требования к культивированию клеток ex vivo и посеву скаффолдов являются трудоемкими и ресурсоемкими. Эти факторы препятствовали клинической трансляции тканеинженерных каркасов, несмотря на несколько десятилетий исследований в этой области. Снижая сложность, а также финансовые и материальные требования, тканеинженерные каркасы могут быть внедрены в современную хирургию в широком масштабе, решая как редкие, так и более распространенные процедуры.
Коллаген ранее был признан жизнеспособной платформой для клеточного роста и, кроме того, действует как благоприятный биоадгезив при прикреплении клеток или тканей к каркасу для хирургической имплантации 15,16,17. Периоперационная аутологичная микропластика позволяет обойти необходимость культивирования клеток ex vivo путем забора интересующей ткани во время первичной процедуры и ее непосредственной реимплантации. За счет измельчения резецированной ткани на более мелкие частицы увеличивается площадь поверхности и потенциал роста, что позволяет увеличить коэффициент расширения на каркасе18. Каркас на основе коллагена не прилипает конкретно к урогенитальной реконструкции, но теоретически может применяться к нескольким областям реконструкции полых органов.
В данной рукописи мы представляем как протокол построения трубчатого каркаса, сочетающего коллаген со встроенными аутологичными уротелиальными микрографатами, так и модель минипига, оценивающую техническую осуществимость и безопасность, а также регенеративную эффективность каркаса in vivo. Модель была оценена на 10 взрослых самках минипиг с использованием протокола и метода, представленных здесь. Основным преимуществом скаффолда является простота конструкции и одноэтапная имплантация, избавляющая пациента от нескольких последующих хирургических вмешательств. Процедура может быть выполнена в обычных хирургических условиях обычным хирургическим персоналом и требует стандартного оборудования и материалов. Животная модель позволяет создать контролируемую среду для изучения имплантации, в то время как животное легко возвращается к нормальному поведению, с дополнительной возможностью внесения изменений в каркас и процедуру.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой простую и доступную технику для будущих реконструктивных операций. Общим недостатком тканевой инженерии, включая аутологичную экспансию клеток, являются дорогостоящие и существенные подготовительные шаги, необходимые перед хирургической имплантацией. Аутологичная микротрансплантация может упростить многие из этих этапов и потенциально позволяет проводить одноэтапные процедуры. Путем аутотрансплантации сложных гистологических образований индуцируется прорегенеративная паракринная сигнализация18. В предыдущих исследованиях мы убедились, что микротрансплантаты сами по себе уязвимы к физической среде, если они не прикреплены соответствующим образом к каркасу15,19. Коллаген был изучен как жизнеспособная среда для расширения тканей in vitro и был выбран для нашей цели из-за его благоприятной биосовместимости и коммерческой доступности. Представленный здесь композитный каркас ранее был оптимизирован в ходе экспериментов in vitro, оценивающих вариации встраивания микротрансплантата и концентрации коллагена20,21,22. Перед тестированием in vivo свойства каркаса в отношении проницаемости, биомеханики и деградации были оценены in vitro20. Кроме того, расширение тканей на основе каркаса in vivo было ранее валидировано на моделях грызунов и кроликов21,22.
Хирургическая модель была выбрана для оценки трубчатой версии каркаса, имитирующей клинические условия отведения мочи при нейрогенной дисфункции мочевого пузыря у детей или подростков. Важнейшие этапы включают точную диссекцию микротрансплантатов слизистой оболочки и поддержание влажной среды с момента резекции до закладки каркаса. Еще одним важным этапом является правильное затвердевание гидрогеля; Тщательное пипетирование коллагена гарантирует, что внутри геля не образуются пузырьки воздуха, а правильные настройки температуры и составные растворы гарантируют, что гель правильно затвердеет. Неполучение застывшего геля повысит риск расслоения коллагена и отслоения микротрансплантата. Что касается хирургической части, осторожное обращение во время имплантации имеет решающее значение, чтобы избежать повреждения микротрансплантатов из-за механической травмы или диссоциации. Перед закрытием брюшной полости следует тщательно решить проблему проходимости жидкости путем инсуффляции мочевого пузыря жидкостью.
Ограничения метода включают в себя толщину каркаса, который интуитивно имеет верхние пределы в отношении диффузии питательных веществ из внешней среды к микротрансплантатам. С другой стороны, уменьшение толщины каркаса может привести к неоправданно высокой проницаемости и утечке мочи. Наш текущий состав основан на предыдущих оценках in vitro , где сравнивали регенерацию клеток при различных концентрациях коллагена20. Микротрансплантация аутологичных тканей также опирается на здоровую ткань трансплантата, что делает текущую процедуру непригодной для злокачественных заболеваний, когда риск ретрансплантации рака не может быть должным образом исключен23; Тем не менее, текущий метод был разработан для случаев с функциональными нарушениями мочеиспускания, когда это не считается риском. Несмотря на то, что модель имитирует несколько этапов из клинических условий (т.е. процедуру аппендиковезикостомии), в этом эксперименте не используется полностью функциональная стома для отведения мочи, поскольку кондуит лигируется дистально. Кроме того, поскольку клинические осложнения могут возникать на протяжении всей жизни, 6-недельный период наблюдения может дать ограниченные знания о конкретных исходах стриктур и недержания. Таким образом, дополнительное 6-месячное наблюдение может быть добавлено к исследованию после анастомозирования зажившего канала до уровня кожи.
Перспектива этого метода связана с простой конструкцией, обеспечивающей универсальное применение в случае, если микротрансплантат, происходящий из ткани и поддерживающий биоматериал, заменяется другими соответствующими альтернативами. Эти компоненты могут быть модифицированы в соответствии с конкретными для органов целями, связанными с прочностью, эластичностью и биодеградацией каркаса. Наконец, доступность и невысокая стоимость обеспечивают воспроизводимость и расширенный перевод техники.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают признательность сотрудникам Департамента экспериментальной медицины (AEM) Копенгагенского университета за помощь в планировании и проведении операций и содержания животных, а также компании ELLA-CS, s.r.o, Градец Кралове, Чешская Республика, за предоставление биоразлагаемых стентов по индивидуальному заказу, использованных в исследовании. Финансовую поддержку оказали Шведское общество медицинских исследований, Фонд Promobilia, Фонд Rydbeck, Фонд Samariten, Фонд педиатрического здравоохранения, Фонд Frimurare Barnhuset в Стокгольме и Фонд Novo Nordisk (NNFSA170030576).
Materials
| 10x MEM | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US | 2517592 | Collagen preparation |
| 1x MEM | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, US | 2508924 | Collagen preparation |
| Ambu aScope 4 Cysto | Ambu A/S, Ballerup, DK | 1000682507 | Cystoscope |
| Aquaflush ACE stopper | Abena, Taastrup, DK | ACE12/220501 | ACE stopper |
| Borgal vet inj opl 200 + 40 mg/mL | Ceva Animal Health A/S | 510460 | Sulfonamide/Trimethoprim |
| Bupaq multidose vet 0.3 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 502763 | Buprenorphin |
| Butomidor vet inj 10 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 531943 | Buthorphanol |
| Comfortan vet inj 10 mg/mL | Dechra Veterinary Products A/S, DK | 492312 | Metadone |
| Ethilon suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SGBCXV | Monofilament non-resorbable |
| Fentanyl inj 50 µg/mL(hamel) | Hameln Pharma ApS, DK | 432520 | Fentanyl |
| Ketador vet inj 100 mg/mL | Salfarm Danmark A/S, DK | 115727 | Ketamine |
| Metacam inj 20 mg/mL t.cattle/pig/horse | Boehringer Ingelheim Animal, DE | 6443 | Meloxcicam |
| Metacam oral suspension 15 mg/mL pigs | Boehringer Ingelheim Animal, DE | 482780 | Meloxcicam |
| Omnipaque | GF Healthcare, Oslo, NO | 16173849 | Contrast for CT |
| Pancytokeratin CK-AE | DAKO Agilent, US | GA053 | Clone AE1/AE3 |
| PDS suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SEMMTQ | Monofilament slow-resorbable |
| Prolene suture 4-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | PGH187 | Monofilament non-resorbable |
| Propolipid t.inj/inf 10 mg/mL | Fresenius Kabi, DK | 21636 | Propofol |
| Rat-tail collagen type I | First Link Ltd, Wolverhampton, UK | 60-30-810 | 2.06 mg/mL protein in 0.6% acetic acid |
| Suprim vet 20 + 100 mg (Solution for use in drinking water) | Dechra Veterinary Products A/S, DK | 33661 | Sulfonamide/Trimethoprim |
| SX-ELLA Degradable Biliary DV stent | ELLA-CS, Trebes, CZ | S23000056-01 | ø 6 mm x 60 mm |
| Vicryl mesh | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | VM1208 | Mesh |
| Vicryl suture 4-0 | Ethicon, Johnson & Johnson, New Brunswick, US | SMBDGDR0 | Braided fast-resorbable |
| Xysol vet inj 20 mg/mL | ScanVet Animal Health A/S, DK | 54899 | Xylazine |
| Zoletil 50 vet plv/sol t.inj 25 + 25 mg/mL | Virbac Danmark A/S, DK | 568527 | Tiletamine and Zolazepam |
Riferimenti
- Surer, I., Ferrer, F. A., Baker, L. A., Gearhart, J. P. Continent urinary diversion and the exstrophy-epispadias complex. J Urol. 169 (3), 1102-1105 (2003).
- Cranidis, A., Nestoridis, G. Bladder augmentation. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 11 (1), 33-40 (2000).
- Atala, A., Bauer, S. B., Hendren, W. H., Retik, A. B. The effect of gastric augmentation on bladder function. J Urol. 149 (5), 1099-1102 (1993).
- Husmann, D. A. Mortality following augmentation cystoplasty: A transitional urologist’s viewpoint. J Pediatr Urol. 13 (4), 358-364 (2017).
- Mitrofanoff, P. Trans-appendicular continent cystostomy in the management of the neurogenic bladder. Chir Pediatr. 21 (4), 297-305 (1980).
- Leslie, B., Lorenzo, A. J., Moore, K., Farhat, W. A., Bägli, D. J., Pippi Salle, J. L. Long-term followup and time to event outcome analysis of continent catheterizable channels. J Urol. 185 (6), 2298-2302 (2011).
- Horst, M., Eberli, D., Gobet, R., Salemi, S. Tissue engineering in pediatric bladder reconstruction-The road to success. Front Pediatr. 7, 91 (2019).
- Ajalloueian, F., Lemon, G., Hilborn, J., Chronakis, I. S., Fossum, M. Bladder biomechanics and the use of scaffolds for regenerative medicine in the urinary bladder. Nat Rev Uro. 15 (3), 155-174 (2018).
- Dorin, R. P., Pohl, H. G., De Filippo, R. E., Yoo, J. J., Atala, A. Tubularized urethral replacement with unseeded matrices: what is the maximum distance for normal tissue regeneration. World J Uro. 26 (4), 323-326 (2008).
- El Kassaby, A. W., AbouShwareb, T., Atala, A. Randomized comparative study between buccal mucosal and acellular bladder matrix grafts in complex anterior urethral strictures. J Urol. 179 (4), 1432-1436 (2008).
- Casarin, M., et al. Porcine small intestinal submucosa (SIS) as a suitable scaffold for the creation of a tissue-engineered urinary conduit: Decellularization, biomechanical and biocompatibility characterization using new approaches. Int J Mol Sci. 23 (5), 2826 (2022).
- Casarin, M., et al. A novel hybrid membrane for urinary conduit substitutes based on small intestinal submucosa coupled with two synthetic polymers. J Funct Biomater. 13 (4), 222 (2022).
- Drewa, T. The artificial conduit for urinary diversion in rats: a preliminary study. Transplant Proc. 39 (5), 1647-1651 (2007).
- Liao, W., et al. Tissue-engineered tubular graft for urinary diversion after radical cystectomy in rabbits. J Surg Res. 182 (2), 185-191 (2013).
- Reinfeldt Engberg, G., Lundberg, J., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. Transplantation of autologous minced bladder mucosa for a one-step reconstruction of a tissue engineered bladder conduit. Biomed Res Int. 2013, 212734 (2013).
- Ajalloueian, F., Nikogeorgos, N., Ajalloueian, A., Fossum, M., Lee, S., Chronakis, I. S. Compressed collagen constructs with optimized mechanical properties and cell interactions for tissue engineering applications. Int J Biol Macromol. 108, 158-166 (2018).
- Chamorro, C. I., Zeiai, S., Engberg, G. R., Fossum, M. Minced tissue in compressed collagen: A cell-containing biotransplant for single-staged reconstructive repair. J Vis Exp. 108, 53061 (2016).
- Juul, N., et al. Insights into cellular behavior and micromolecular communication in urothelial micrografts. Sci Rep. 13 (1), 13589 (2023).
- Reinfeldt Engberg, G., Chamorro, C. I., Nordenskjöld, A., Fossum, M. Expansion of submucosal bladder wall tissue in vitro and in vivo. Biomed Res Int. 2016, 5415012 (2016).
- Juul, N., Ajalloueian, F., Willacy, O., Chamorro, C. I., Fossum, M. Advancing autologous urothelial micrografting and composite tubular grafts for future single-staged urogenital reconstructions. Sci Rep. 13 (1), 15584 (2023).
- Willacy, O., Juul, N., Taouzlak, L., Chamorro, C. I., Ajallouiean, F., Fossum, M. A perioperative layered autologous tissue expansion graft for hollow organ repair. Heliyon. 10 (3), e25275 (2024).
- Chamorro, C. I., et al. Exploring the concept of in vivo guided tissue engineering by a single-stage surgical procedure in a rodent model. Int J Mol Sci. 23 (20), 12703 (2022).
- Casarin, M., Morlacco, A., Dal Moro, F. Bladder substitution: The role of tissue engineering and biomaterials. Process. 9 (9), 1643 (2021).
.