Quantifizierung des 8-Oxo-dG-Gehalts mittels ELISA-Assay zur Bewertung oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen

Die oxidative Schädigung der DNA ist die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und dem zellulären antioxidativen Abwehrsystem¹. Es handelt sich hauptsächlich um die Oxidation von DNA, Purin und Pyrimidinbasen, ^2,3. Diese oxidative Modifikation der DNA-Basen beeinträchtigt nicht nur die Integrität des Genoms, sondern umfasst auch ein breites Spektrum pathologischer Probleme, darunter Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ^4,5. Die Guaninbase in der DNA hat das geringste Reduktionspotenzial und ist am anfälligsten für Oxidation⁶. Daher dient 8-Oxo-7,8-dihydro-2′-desoxyguanosin (8-oxo-dG) als primärer Marker zur Beurteilung des Ausmaßes der oxidativen Schädigung der DNA ^7,8. Die genaue Quantifizierung von 8-Oxo-dG ist zu einem kritischen Thema geworden, wenn es darum geht, verschiedene Aspekte des Auftretens, des Fortschreitens und der Bewertung der multifaktoriellen oxidativen Belastung^{zu behandeln 9}.

Die traditionellen Methoden zum Nachweis von 8-Oxo-dG, wie z. B. die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD), die Massenspektrometrie und verwandte Bindestrichtechniken, weisen eine hohe Sensitivität und Spezifität auf 10,11,12. Diese Techniken sind jedoch oft mit komplexen betrieblichen Anforderungen und hohen Kosten verbunden, was ihre breite Anwendbarkeit und Praktikabilität in der Hochdurchsatz-Probenanalyse behindert. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung von Wissenschaft und Technologie ist eine Vielzahl neuer, effizienter und genauer Methoden entstanden. Die Anwendung dieser neuen Technologien ermöglicht es uns, den 8-Oxo-dG-Gehalt genauer zu quantifizieren und leistungsfähigere Werkzeuge für eine eingehende Untersuchung des Zusammenhangs zwischen oxidativem Stress und Krankheit bereitzustellen. So haben Forscher beispielsweise die Nanoporentechnologie eingesetzt, um DNA¹³ quantitativ nachzuweisen und zu sequenzieren, DNA-Schadenstypen mit einer Single-Click-Code-Sequenzierungsstrategie¹⁴ zu identifizieren, Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden zu entwickeln und 8-OxoG-basierte Biosensoren durch Integration von Biotin-Streptavidin in ELISA^{herzustellen 15}. Unter ihnen ist ELISA mit seinen anerkannten Vorteilen in Bezug auf Spezifität, Hochdurchsatz-Screening und Kosten eine der idealen Lösungen für den 8-Oxo-dG-Nachweis. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine hochempfindliche, komfortable und schnelle Methode mit hohem Durchsatz zum Nachweis von 8-Oxo-dG zu entwickeln.

Die 1971¹⁶ entwickelte ELISA-Technik (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) hat sich in den letzten 50 Jahren rasant weiterentwickelt und ist heute eine der am häufigsten verwendeten Nachweismethoden in den Bereichen Biologie und Medizin 17,18,19. Die ELISA-Technologie weist eine hohe Sensitivität und Spezifität auf, verfügt über eine kurze Reaktionszeit und ist einfach zu bedienen, was sie zu einer weithin anerkannten Wahl für groß angelegte Probentests und Hochdurchsatzanalysen macht²⁰. Infolgedessen wurde ELISA in großem Umfang für die quantitative oder semiquantitative Analyse von Verbindungen, Proteinen, Antikörpern oder Molekülen in Zellen verwendet 21,22,23. Zum Beispiel wurde es bei der Detektion von Biomarkern eingesetzt, die mit verschiedenen Krankheiten, Arzneimittelrückständen und Biomolekülen assoziiert sind²⁴. ELISAs können auf der Grundlage des Versuchsdesigns und der Prinzipien in vier Haupttypen eingeteilt werden²⁵. Zu diesen Methoden gehören der direkte ELISA, der indirekte ELISA, der Sandwich-ELISA und der kompetitive ELISA^26,27. Unter diesen wurde für die Studie in dieser Arbeit der Sandwich-ELISA ausgewählt, der zwei spezifische Antikörper verwendet, einen für das Einfangen des Zielmoleküls und einen für den Nachweis. Das experimentelle Prinzip des Sandwich-ELISA ist wie folgt: Zuerst wird ein spezifischer Antikörper in den Vertiefungen einer Mikroplatte immobilisiert, um den interessierenden Analyten einzufangen. Nachdem der Standard oder die Probe hinzugefügt wurde, bindet der Zielanalyt an den immobilisierten Antikörper. Anschließend wird ein markierter Antikörper hinzugefügt, der ein anderes Epitop auf dem Antigen erkennt, wodurch eine Sandwichstruktur gebildet wird. Nach der Entfernung der ungebundenen Antikörper wird ein Substrat hinzugefügt. Unter der katalytischen Wirkung des Sekundärantikörpers tritt eine Farbreaktion auf, und die Intensität der Farbe korreliert positiv mit der Konzentration des Zielanalyten in der Probe. Abschließend wurde die optische Dichte (OD) gemessen, um die Konzentration der Probe zu bestimmen. Der Sandwich-ELISA hat die Vorteile einer erhöhten Sensitivität und Spezifität für Zielproben, wodurch er für den Nachweis niedriger Konzentrationen von Zielanalyten und komplexen Proben geeignet ist²⁸. Darüber hinaus können die erzielten Ergebnisse für die weitere Analyse quantifiziert werden. Diese Faktoren machen den Sandwich-ELISA zu einer häufig verwendeten Nachweismethode sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch in klinischen Laboratorien²⁹.

Ziel dieser Studie war es, 8-Oxo-dG in MCF-7-Zellen quantitativ nachzuweisen, um den Grad der oxidativen DNA-Schädigung in den Zellen zu bestimmen. Diese Studie besteht aus zwei Hauptteilen: der Konstruktion eines MCF-7-Zell-DNA-Modells für oxidative Schäden und dem Nachweis von 8-Oxo-dG mittels ELISA. Zunächst wurden MCF-7-Zellen in vitro kultiviert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von H₂O₂ für unterschiedliche Zeiträume behandelt. Die Zellviabilität wurde mit einem CCK-8-Assay untersucht, um die halbmaximale Hemmkonzentration (IC₅₀) von H₂O₂ in MCF-7-Zellen zu bestimmen. Basierend auf den IC_50-Werten wurde eine geeignete H₂O₂ -Behandlungszeit und Induktionskonzentration gewählt. Um Proben von MCF-7-Zellen zu extrahieren, die durch Oxidation geschädigt wurden, wurden Zellproben und Überstände entnommen und in enzymverknüpfte Vertiefungen gegeben, die zuvor mit 8-Oxo-dG-Antikörpern beschichtet waren. Das in der Probe vorhandene 8-Oxo-dG bindet an die Antikörper, die an den Festphasenträger gebunden sind. Dann wurden 8-Oxo-dG-Antikörper hinzugefügt, die mit Meerrettichperoxidase markiert waren. Das Reaktionsgemisch wurde bei konstanter Temperatur inkubiert, um eine vollständige Bindung der Probe an den Antikörper zu gewährleisten. Das ungebundene Enzym wurde durch Waschen entfernt, und dann wurde das kolorimetrische Substrat hinzugefügt, das eine blaue Farbe erzeugte. Unter Einwirkung von Säure färbte sich die Lösung. Schließlich wurde der OD-Wert der Reaktionstopfproben bei 450 nm gemessen, und die Konzentration von 8-Oxo-dG in der Probe war proportional zum OD-Wert. Durch die Erstellung einer Standardkurve kann die Konzentration von 8-Oxo-dG in der Probe berechnet werden.