Количественная оценка уровня 8-оксо-dG с помощью ИФА-анализа для оценки окислительного повреждения ДНК в клетках MCF-7

Окислительное повреждение ДНК является следствием дисбаланса между образованием активных форм кислорода (АФК) и клеточной системой антиоксидантной защиты¹. В первую очередь он включает в себя окисление ДНК пуриновых и пиримидиновых оснований ^2,3. Эта окислительная модификация оснований ДНК не только нарушает целостность генома, но и охватывает широкий спектр патологических проблем, включая рак, нейродегенеративные заболевания и сердечно-сосудистые^{заболевания.} Основание гуанина в ДНК имеет самый низкий восстановительный потенциал и наиболее подвержено окислению⁶. Таким образом, 8-оксо-7,8-дигидро-2′-дезоксигуанозин (8-оксо-dG) служит первичным маркером для оценки степени окислительного повреждения ДНК ^7,8. Точное количественное определение 8-оксо-dG стало критически важным вопросом при рассмотрении различных аспектов возникновения, прогрессирования заболевания и оценки многофакторной окислительной нагрузки⁹.

Традиционные методы детектирования 8-оксо-дГ, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим детектированием (ВЭЖХ-ЭКД), масс-спектрометрия и связанные с ней методы с использованием дефиса, обладают высокой чувствительностью и специфичностью 10,11,12. Однако эти методы часто имеют сложные эксплуатационные требования и высокую стоимость, что препятствует их широкому применению и практичности при анализе образцов с высокой пропускной способностью. С непрерывным развитием науки и техники появилось множество новых, эффективных и точных методов. Применение этих новых технологий позволяет нам более точно количественно определять уровень 8-оксо-dG и предоставляет более мощные инструменты для углубленного изучения связи между окислительным стрессом и болезнями. Например, исследователи применили технологию нанопор для количественного обнаружения и секвенирования ДНК¹³, идентификации типов повреждений ДНК с помощью стратегии секвенирования кода¹⁴ одним щелчком мыши, разработки методов высокопроизводительного секвенирования и создания биосенсоров на основе 8-оксоG путем интеграции биотин-стрептавидина с ИФА¹⁵. Среди них ИФА, с ее признанными преимуществами с точки зрения специфичности, высокой пропускной способности скрининга и стоимости, является одним из идеальных решений для обнаружения 8-оксо-dG. Поэтому крайне важно разработать высокопроизводительный, высокочувствительный, удобный и быстрый метод обнаружения 8-оксо-дГ.

Метод иммуноферментного анализа (ИФА), разработанный в 1971-16 гг., быстро развивался в течение последних 50 лет и в настоящее время стал одним из наиболее часто используемых методов обнаружения в области биологии и медицины 17,18,19. Технология ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, коротким временем реакции и простотой в использовании, что делает ее широко признанным выбором для тестирования крупномасштабных образцов и высокопроизводительного анализа²⁰. В результате, ИФА широко используется для количественного или полуколичественного анализа соединений, белков, антител или молекул в клетках 21,22,23. Например, он был использован для обнаружения биомаркеров, связанных с различными заболеваниями, остатками лекарств и биомолекулами24. ИФА можно разделить на четыре основных типа в зависимости от плана эксперимента и принципов²⁵. К таким методам относятся прямой ИФА, непрямой ИФА, сэндвич-ИФА и конкурентный ИФА ^26,27. Среди них для исследования в данной статье был выбран сэндвич-ИФА, в котором используются два специфических антитела, одно из которых предназначено для захвата молекулы-мишени, а другое – для детектирования. Экспериментальный принцип сэндвич-ИФА заключается в следующем: сначала специфическое антитело иммобилизуется в лунках микропланшета для захвата интересующего аналита. После добавления стандарта или образца целевой аналит связывается с иммобилизованным антителом. Затем добавляется меченое антитело, которое распознает другой эпитоп на антигене, образуя сэндвич-структуру. После удаления несвязанных антител добавляют субстрат. Под каталитическим действием вторичного антитела происходит цветовая реакция, причем интенсивность цвета положительно коррелирует с концентрацией целевого аналита в образце. Наконец, измеряли оптическую плотность (OD) для определения концентрации образца. Сэндвич ИФА обладает преимуществами повышенной чувствительности и специфичности для целевых образцов, что делает его пригодным для детектирования низких концентраций целевых аналитов и сложных образцов²⁸. Кроме того, полученные результаты могут быть количественно оценены для дальнейшего анализа. Эти факторы делают сэндвич-ИФА широко используемым методом обнаружения как в научных исследованиях, так и в клинических лабораториях²⁹.

Данное исследование было направлено на количественное обнаружение 8-оксо-dG в клетках MCF-7 для определения степени окислительного повреждения ДНК в клетках. Данное исследование состоит из двух основных частей: построения модели окислительного повреждения ДНК клеток MCF-7 и детектирования 8-оксо-dG с помощью ИФА. Во-первых, клетки MCF-7 культивировали in vitro и обрабатывали различными концентрациями_H2O2в течение разного времени. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа CCK-8 для определения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC_{50) H2}O₂ в клетках MCF-7. На основе значений IC₅₀ были выбраны подходящее время обработки H₂O₂ и индукционная концентрация. Для извлечения образцов поврежденных окислением клеток MCF-7 были получены образцы клеток и надосадочной жидкости, которые были добавлены в ферментные лунки, ранее покрытые антителами 8-oxo-dG. 8-оксо-dG, присутствующий в образце, будет связываться с антителами, связанными с твердофазным носителем. Затем добавляли антитела 8-оксо-dG, меченные пероксидазой хрена. Реакционную смесь инкубировали при постоянной температуре, чтобы обеспечить полное связывание образца и антитела. Несвязанный фермент удаляли путем промывки, а затем добавляли колориметрическую подложку, которая давала синий цвет. Под действием кислоты раствор становился желтым. Наконец, значение наружного диаметра образцов из реакционной лунки измеряли на длине волны 450 нм, а концентрация 8-оксо-dG в образце была пропорциональна значению наружного диаметра. С помощью стандартной кривой можно рассчитать концентрацию 8-оксо-dG в образце.