O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais da Sociedade Max Planck e aprovados pelo comitê de ética do governo local (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Código de aprovação do projeto: F149-2000). Figura 1: Projeto do implante. (A) Renderização 3D do implante sobreposto a um crânio de camundongo com uma sonda de silício conectada a um conector de sonda. A abertura central da placa de cabeça é de aproximadamente 10 mm para escala. A altura da unidade é de aproximadamente 17 mm. A malha de cobre que forma a parte externa da coroa de Faraday, bem como os fios terra/ref, não são mostrados. (B) O mesmo que (A) com uma conexão a um amplificador placa em vez de um conector de sonda. (C) Desenho técnico explodido do implante, mostrando seus componentes. (D) Renderização de um espaçador angular que pode ser implantado sob um microdrive, permitindo implantar consistentemente o microdrive em um ângulo predefinido (aqui: 20°). (E) Renderização do mecanismo integrado de fixação da cabeça, mostrando a placa de cabeça implantada com a coroa de Faraday com a braçadeira de fixação da cabeça circundante e a conexão em cauda de andorinha para configuração. (F) Imagem da cabeça do rato fixada em uma esteira usando o mecanismo de fixação da cabeça integrado do implante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. NOTA: As seções 1 e 2 discutem os preparativos pré-cirúrgicos 1. Preparação da sonda de silício Em caso de reutilização da sonda, limpe a sonda de silicone de acordo com as recomendações do fornecedor da sonda. Mergulhe a sonda em limpador enzimático (consulte a Tabela de Materiais) por 5-10 min e depois enxágue em água desmineralizada. Faça isso o mais rápido possível após o explante. Um dia antes do (re)implante, mergulhe a sonda em etanol a 70% por pelo menos 30 minutos para desinfecção. Meça as impedâncias do canal para garantir que estejam dentro das especificações do sinal gravado. Siga o protocolo para testar os níveis de ruído do manual do usuário Neuropixels22, meça a impedância por meio do software de gravação desejado (por exemplo, https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) e siga as impedâncias do canal alvo do fabricante da sonda de silício ou folha de dados. Se as impedâncias forem muito altas, considere revestir os locais dos eletrodos23. Solde um soquete de cauda de solda de 0.05″ (consulte a Tabela de Materiais) ao fio terra (GND) da sonda. Conecte o soquete ao pino GND (próximo passo) durante a cirurgia.NOTA: Neste protocolo, um pino de referência separado (REF) não é usado, pois GND e REF estão em curto no headstage usado. Portanto, apenas o pino GND será mencionado no restante do protocolo. Se um REF separado for usado, repita a etapa a seguir para o pino REF. Para preparar o pino GND, insira repetidamente o lado do pino de um soquete traseiro de solda de 0.05″ (consulte a Tabela de Materiais) no soquete traseiro de solda GND 0.05″ até que a inserção seja praticamente sem esforço. O uso de alfinetes banhados a ouro pode reduzir a necessidade dessa etapa de suavização. Isso garante que o pino e o soquete GND possam ser facilmente conectados durante a cirurgia sem a necessidade de aplicar pressão excessiva, reduzindo o risco de ferimentos ao animal e danos à sonda. Se for usado um pré-amplificador implantável para a sonda de silicone, prepare-os para implantação crônica seguindo os procedimentos do fornecedor. Em seguida, conecte o amplificador/conector ao anel da gaiola de Faraday usando gesso de silicone para colá-lo na área do anel de Faraday projetado para segurar o amplificador (consulte a Figura 1).NOTA: A preparação do pré-amplificador implantável para a sonda de silício para implantação crônica seguindo os procedimentos do fornecedor pode incluir revesti-los com silicone ou epóxi para evitar que a umidade danifique os componentes eletrônicos, bem como acoplar repetidamente o conector do amplificador para reduzir a força de acoplamento ao conectar o amplificador ao sistema de gravação durante as gravações. Isso é especialmente útil para usuários do Omnetics. 2. Preparação do microdrive e do capacete Gire o parafuso no corpo do microdrive de modo que o vaivém do microdrive fique quase totalmente retraído para cima. Opcionalmente, conecte um espaçador angular (consulte a Figura 1D) à parte inferior do microdrive com cola de cianoacrilato ou cimento dentário, que pode ser usado para permitir que um grau específico de inclinação seja usado, por exemplo, ao gravar através de camadas corticais em uma região dentro do sulco central ou dentro de estruturas profundas que podem exigir uma abordagem não perpendicular (para espaçador angular, ver Tabela de Materiais). Coloque o microdrive horizontalmente no suporte do microdrive (Figura Suplementar 1). Coloque um pequeno pedaço de massa adesiva (consulte a Tabela de Materiais) no suporte do microdrive a uma distância acima do microdrive no qual o conector do estágio principal será colocado. Essa distância depende do comprimento do cabo flexível que conecta a sonda de silício ao conector do headstage. Coloque uma pequena gota de gesso de silicone (consulte a Tabela de Materiais) na lançadeira. Retire a sonda de silicone de sua embalagem com a ajuda de uma pinça de ponta macia e romba. Faça-os revestindo pinças de ponta fina padrão com tubos termorretráteis de 3 mm de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais). Coloque a sonda com o cabo flexível primeiro no vaivém do microdrive de modo que a borda inferior do cabo flexível fique ligeiramente pendurada sobre a borda inferior do vaivém do microdrive. Puxe suavemente o cabo flexível em direção à parte superior do microdrive até que a borda inferior do cabo flexível encontre a borda inferior do shuttle do microdrive. Certifique-se de empurrar o cabo flexível contra a borda esquerda do inversor do microdrive durante esta etapa para que ele seja colocado exatamente verticalmente no microdrive na extremidade. Neste ponto, certifique-se de que as hastes da sonda de silicone não se projetem (ou apenas minimamente) além da borda inferior do microdrive (dependendo do comprimento exato das hastes da sonda e da profundidade da área do cérebro alvo). Coloque o conector do estágio principal da sonda na massa adesiva na parte superior do suporte para proteger a sonda de cair. Use uma agulha de seringa de 27 G para aplicar uma pequena gota de cola de cianoacrilato (consulte a Tabela de Materiais) entre o cabo flexível e o vaivém para prender a sonda no lugar. Certifique-se de que a cola não escorra para o microdrive ou ao longo do cabo flexível além do ônibus (isso é muito importante) Assim que o cabo flexível estiver colado na posição, conecte o amplifier ao anel da coroa (consulte a Tabela de Materiais) usando gesso de silicone. Em seguida, conecte o cabo flexível ao amplificador e cubra a conexão e o cabo com uma fina camada de gesso de silicone. Após 5 min, quando o gesso estiver endurecido, guarde o microdrive e a sonda com segurança até o uso posterior. Corte pedaços de malha de cobre (consulte a Tabela de Materiais) em uma forma de rosquinha aberta (consulte o padrão de corte na Figura Suplementar 2) para cobrir a gaiola de Faraday. Prenda o recorte da malha de cobre na gaiola de Faraday com pequenas gotas de resina epóxi (consulte a Tabela de Materiais). Para esta etapa, pode-se também substituir o epóxi por cimento dentário.NOTA: A gaiola de Faraday contém um espaço para abrigar um conector de sonda ou amplificador. Este espaço é marcado por um X no arquivo de design e contém uma base de suporte para o amplificador/conector, bem como uma distância maior entre os dois raios adjacentes da gaiola. Para criar espaço suficiente ao redor do amplificador/conector, fixe uma pequena quantidade de malha extra entre os dois raios adjacentes, criando uma saliência. Isso garante que o amplificador/conector possa ser posicionado posteriormente neste ‘bolso’ sem tocar na gaiola de Faraday. Para garantir uma adesão segura com o mínimo de empenamento, use o anel da coroa colocado diretamente na coroa para manter a forma e apoiar os raios finos da coroa. Além disso, use mãos de ajuda de solda para prender a coroa e a malha durante a secagem. Se alguém se esforçar para manter a forma da coroa ao se submeter ao procedimento, tente epóxi apenas dois dos braços da coroa de cada vez para evitar empenamento. Se desejar o aterramento separado da gaiola de Faraday, solde um pequeno pino coletor em um fio de aterramento de 30 mm (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, use epóxi condutor para aderir o fio ao recorte da malha de cobre.NOTA: Esta etapa não é seguida no laboratório. Neste ponto, armazene as peças preparadas com segurança e realize a cirurgia em um estágio posterior.NOTA: As seções 3-6 discutem a implantação do microdrive e do arnês. 3. Cirurgia: Preparação da sonda e do espaço de trabalho Esterilize e coloque instrumentos cirúrgicos no espaço de trabalho cirúrgico após um procedimento aprovado.NOTA: Isso pode incluir o uso de um esterilizador de esferas, instrumentos de autoclavagem ou enxágue com peróxido a 30% ou etanol a 90%, dependendo do protocolo experimental aprovado. Coloque o prato de cerâmica usado para preparar o cimento dental em uma caixa de gelo, geladeira ou freezer, seguindo as instruções do kit de cimento dental (consulte a Tabela de Materiais). Use o prato de cerâmica resfriado durante a mistura do cimento para aumentar o tempo em que o cimento é maleável. Use um prato resfriado sempre que forem necessárias etapas de cimentação mais longas. Se a verificação histológica da colocação da sonda no final do experimento for desejada, estenda a sonda de silicone logo antes da cirurgia girando o parafuso no microdrive no sentido anti-horário e aplique um corante lipofílico (consulte a Tabela de Materiais) na sonda mergulhando-a em uma pequena gota do corante. Prepare o corante lipofílico a partir de uma solução de estoque diluída de dimetilsulfóxido (DMSO) ou etanol (EtOH) comprada comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) diluindo-o em um tampão adequado, como PBS, a uma concentração de 1-5 μM. 4. Cirurgia: Preparação do animal Siga um protocolo de anestesia aprovado para uma cirurgia de roedores de 2 a 4 horas em condições assépticas. Isso pode incluir anestesia geral e local, analgesia, aplicação de pomadas para os olhos e injeções de solução salina. Aqui, use anestesia injetável (cetamina 100 [mg / kg] / medetomidina 0,5 [mg / kg]) junto com creme de analgesia local e pomada para os olhos (consulte a Tabela de Materiais) e coloque o animal em uma almofada de aquecimento para regular a temperatura corporal. Quando o animal estiver totalmente anestesiado, mova-o para uma área de barbear não estéril separada.Certifique-se de que o animal seja aquecido o suficiente; Por exemplo, coloque-o em uma almofada de aquecimento. Remova os pelos na parte superior do crânio. Faça isso com um barbeador elétrico ou creme de depilação (consulte a Tabela de Materiais) ou raspando repetidamente o topo da cabeça com um bisturi coberto com etanol 70%. Remova cuidadosamente os pelos soltos para garantir que eles não entrem em contato com o tecido exposto posteriormente. Para remover os pelos, use, por exemplo, lenços umedecidos com etanol 70% e/ou uma bomba de esferas de compressão. Se estiver usando creme de depilação, certifique-se de que ele seja removido com cotonetes e soro fisiológico. Desinfete a área raspada várias vezes com um desinfetante à base de iodo (consulte a Tabela de Materiais) e álcool usando cotonetes, movendo-se do centro da cabeça para os lados para afastar os pelos soltos restantes do local da incisão. Desinfete o pelo na cabeça e ao redor da cabeça usando betadine. Isso garante uma área de trabalho estéril e protege os instrumentos e materiais cirúrgicos de entrar em contato com peles não esterilizadas. Coloque o animal em uma estrutura estereotáxica usando barras auriculares e suporte de nariz (consulte a Tabela de Materiais). Usando uma pequena tesoura cirúrgica (ver Tabela de Materiais), corte uma abertura em forma de amêndoa na pele no topo do crânio, alcançando apenas a parte posterior da sutura lambda até entre os olhos. Remova a membrana subcutânea e o periósteo cortando ainda úmido e, em seguida, coce o crânio com uma lâmina de bisturi para remover o tecido macio da superfície do crânio que pode impedir a adesão do cimento dentário. Opcional: Uma vez que o crânio tenha sido limpo do tecido da membrana, aplique brevemente uma fina camada de peróxido a 0,5% e lave-o com desinfetante de iodo à base de água (por exemplo, Betadine) antes de tornar a superfície do crânio áspera para melhorar a adesão do primer ao crânio. Torne cuidadosamente áspera a superfície do crânio arranhando um padrão cruzado com a ponta do bisturi virada de cabeça para baixo. Isso ajuda o cimento dentário a aderir ao crânio mais tarde.NOTA: Não coce com muita força em cima das suturas, pois isso pode causar a ruptura das suturas e vazamento de fluido intracraniano, o que prejudica a adesão do cimento dentário. Alterne entre lâmina de bisturi e cotonetes estéreis para arranhar / empurrar suavemente os músculos do pescoço presos às laterais da sutura lambda até que os músculos tenham sido empurrados de volta para a ‘borda’ do crânio no topo do cerebelo. Isso ajuda a minimizar o ruído muscular nas gravações neuronais. Encha uma seringa de 1 mL com uma agulha de 27 G (consulte a Tabela de Materiais) com pequenas quantidades de cola cirúrgica de cianoacrilato (consulte a Tabela de Materiais). Em seguida, cole a pele nas bordas do crânio usando a seringa para espalhar pequenas gotas de supercola sobre ela. Cole o tecido o mais plano possível no crânio para deixar espaço para implantes. Esse procedimento garante que a pele e os músculos não entrem em contato direto com partes do implante, o que evita ruídos musculares nos registros e melhora a adesão do cimento dentário. Aplique primer de cimento dental em todo o crânio para adesão extra e endureça com luz ultravioleta (consulte a Tabela de Materiais). Isso melhora a adesão do cimento dentário e evita que as suturas cranianas vazem e enfraqueçam a ligação crânio-cimento ao longo do tempo. Encontre o local de destino para o implante da sonda em relação ao bregma ou lambda e contorne a craniotomia ao redor dele com um marcador cirúrgico. Coloque a placa de cabeça no crânio de forma que a craniotomia fique dentro dela, com espaço para o microdrive em um lado da craniotomia, bem como para 1-2 pinos de aterramento. Implante a placa de cabeça usando cimento dentário. Misture o cimento dental no prato de cerâmica resfriado designado (consulte a etapa 3.2). Certifique-se de que a placa de cabeça adere ao crânio por todos os lados, formando um ‘poço’ estanque. Com uma broca odontológica (tamanho US 1/2 HP), faça um pequeno orifício de rebarba da largura dos pinos do cabeçalho preparados na etapa 1.4 sobre a(s) área(s) do cérebro a ser usada como GND/REF. Se desejar aterrar a gaiola de Faraday, faça outro pequeno orifício próximo à borda da gaiola de Faraday para o pino coletor Faraday-GND.NOTA: Para o(s) pino(s) do cabeçalho GND/REF, coloque a craniotomia a uma distância suficiente da borda da gaiola para que o próprio pino do cabeçalho possa ser colocado dentro dela posteriormente sem tocar na gaiola de Faraday. Limpe a craniotomia pingando suavemente solução salina estéril sobre ela com uma seringa e removendo-a com lenços umedecidos que não derramam (consulte a Tabela de Materiais). Repita até que todo o sangue e tecido solto sejam removidos. Prepare uma solução de ágar 0,7% (ver Tabela de Materiais) em solução salina, resfrie-a levemente e introduza-a na craniotomia usando uma agulha 27 G em uma seringa de 1 mL. Insira suavemente um pino GND (consulte a etapa 1.3) em cada craniotomia perfurada na etapa anterior. O(s) pino(s) será(ão) cercado(s) por ágar em todos os lados (consulte a etapa 4.17). Aplique cimento ao redor dos pinos do cabeçote para prendê-los e fornecer isolamento elétrico. Limpe o prato de cerâmica e coloque-o de volta na geladeira / freezer. Com uma broca dentária, perfure o contorno de uma craniotomia maior (circular ou quadrada) movendo-se ao redor da borda em movimentos constantes. Certifique-se de que a craniotomia seja de 1 mm x 1 mm a 2 mm x 2 mm para permitir pequenos ajustes no posicionamento da sonda para evitar vasos sanguíneos sem expor muito do córtex. Se possível, evite colocar craniotomias sobre suturas. Perfure em rodadas de 20 a 30 s e resfrie o crânio com solução salina entre as rodadas de perfuração.NOTA: Ao iniciar a perfuração, é útil marcar a borda de ataque do microdrive com um marcador, garantindo assim que, ao perfurar, uma borda reta possa ser formada em paralelo à borda de ataque do microdrive. Isso melhora as chances de evitar cimento na craniotomia ao fixar o microdrive no lugar, além de melhorar a aderência, evitando a saliência do microdrive sobre a craniotomia e permitindo maior manobrabilidade lateral ao colocar o microdrive em relação à posição final do local de gravação. Após algumas rodadas iniciais de perfuração, teste a resistência da parte perfurada do osso empurrando-a suavemente com uma pinça fina (tamanho 5 ou mais fino; consulte a Tabela de Materiais).Continue testando entre as rodadas de perfuração até que o osso comece a ‘saltar’ sob a pinça quando empurrado. Quando for esse o caso, adicione uma gota de solução salina em cima da craniotomia para amolecer o osso e, em seguida, use a pinça para remover suavemente o pedaço de osso perfurado. Se o osso não puder ser removido suavemente, faça outra rodada de perfuração, concentrando-se nos pontos onde o osso ainda está preso com mais força. Em geral, tente remover o crânio com uma leve pressão da pinça antes de ser totalmente perfurado, pois isso normalmente minimiza os danos aos tecidos.NOTA: Certifique-se de que a superfície da dura-máter seja umedecida regularmente, tanto durante a perfuração para reduzir as temperaturas quanto após a remoção do retalho ósseo. Isso aumenta as chances de fácil inserção da sonda, evitando que a dura-máter seque e se torne mais difícil de penetrar. Se a dura-máter for muito difícil de penetrar, ou se sondas rombas ou de múltiplas hastes estiverem sendo usadas, uma durotomia é realizada levantando a dura-máter com uma agulha de 27 G e realizando uma pequena incisão sob imersão em solução salina para evitar que a dura-máter grude na superfície do cérebro. Cubra a craniotomia com uma esponja hemostática (ver Tabela de Materiais) embebida em solução salina fria e estéril para proteger a dura-máter e o cérebro. 5. Cirurgia: Implantação da sonda Conecte o suporte de microdrive personalizado (consulte Tabela de materiais) ao braço do aparelho estereotáxico. Se o microdrive foi removido do suporte do microdrive após a preparação da sonda, coloque o microdrive com a sonda de silicone conectada no suporte do microdrive. Incline o braço de estereotaxa, conforme necessário, para alcançar a área desejada do cérebro. Coloque o anel da coroa com o amplificador conectado nos três pinos verticais na parte traseira do suporte do microdrive (consulte a Figura Suplementar 1). Abaixe o microdrive até ~0.5 mm da craniotomia e, em seguida, use uma pinça para conectar o(s) pino(s) do cabeçalho GND/REF conectado(s) à sonda ao(s) pino(s) GND/REF correspondente(s) implantado(s) no crânio (consulte as etapas 4.14-4.15). Consulte a Figura Suplementar 3 e a Figura Suplementar 4 para obter exemplos de acionamento, craniotomia e colocação de pinos GND/REF. Uma vez no lugar, opcionalmente prenda o(s) pino(s) com uma gota de epóxi de prata condutor (consulte a Tabela de Materiais) para uma conexão mais robusta. Uma vez curado o epóxi de prata, cubra os pinos conectados com uma pequena quantidade de cimento dentário (consulte a Tabela de Materiais) para garantir que a conexão permaneça estável por longos períodos e que não haja conexão elétrica com os tecidos circundantes e/ou elementos do implante. Remova a esponja hemostática da craniotomia (consulte a etapa 4.22). Posicione o braço estereotáxico com o microdrive sobre a craniotomia.NOTA: Se a sonda estiver retraída, certifique-se de que o microdrive seja colocado de forma que a sonda toque em uma parte da craniotomia que não contenha grandes vasos sanguíneos. Abaixe o microdrive, se necessário, ajustando a localização e o ângulo até que a haste da sonda toque a dura-máter ou a superfície do cérebro (consulte a etapa 4.21) na área alvo. Misture o cimento dental no prato de cerâmica designado (consulte a etapa 3.2) e cimente a base do microdrive no lugar, concentrando-se nos três lados da base do microdrive que não estão voltados para o eletrodo. Certifique-se de que o cimento não toque no microdrive acima da ‘base’ removível (consulte a Figura 1D).Certifique-se de que qualquer espaço entre a base e o crânio esteja totalmente coberto com cimento dental. Limpe o prato de cerâmica e coloque-o de volta na geladeira / freezer. Aguarde a cura do cimento, aproximadamente 10-15 min.NOTA: Um pequeno espaço é deixado entre a base do microdrive e o crânio, e o cimento é usado em sua forma mais fluida para preenchê-lo. Uma vez que o cimento tenha engrossado ligeiramente, o cimento entre as paredes da base do microdrive e o crânio é construído. Quantidades muito pequenas de cimento são sempre usadas, pois o fluxo da substância pode ser imprevisível e volumes maiores podem fluir para regiões indesejadas. Pequenas quantidades de esponja hemostática embebidas em solução salina podem ser usadas para cobrir partes da craniotomia. Se o cimento fluir acidentalmente para a craniotomia, remova o cimento com uma pinça assim que ele entrar em uma consistência semelhante a um filme. Abaixe a sonda de silício no cérebro, monitorando cuidadosamente a posição da sonda por meio de um microscópio. Quando as hastes da sonda tocarem o cérebro, abaixe a sonda rapidamente em ~ 250 μm (uma volta completa do parafuso é de 282 μm) para garantir que a sonda rompa a resistência da dura-máter/superfície cortical.Verifique isso visualmente. Se a sonda não tiver quebrado o córtex, aguarde 5 minutos e, em seguida, tente gravar a dura-máter com a ponta da haste, levantando e abaixando repetidamente a sonda em algumas dezenas de micrômetros enquanto a dura-máter/córtex está sob tensão da ponta da sonda. Uma vez que a sonda tenha rompido a superfície do córtex, abaixe-a gradualmente em um ritmo mais lento (100-200 μm / min) até que as coordenadas alvo sejam alcançadas ou a sonda tenha se movido mais de 1000 μm. Se o alvo exigir que a sonda se mova mais de 1000 μm, avance a sonda em etapas de no máximo 1000 μm/sessão nas sessões de gravação seguintes até que as coordenadas do alvo sejam alcançadas.NOTA: Pule esta etapa se preferir monitorar sinais neuronais enquanto abaixa a sonda de silício. As etapas para isso são descritas na seção 7. Prepare o elastômero de silicone de acordo com as instruções (consulte a Tabela de Materiais) e dispense uma pequena gota na craniotomia usando uma seringa de 1 mL (consulte a Tabela de Materiais). Depois de seco, cubra o elastômero de silicone com uma mistura 50/50 de cera óssea e óleo mineral. Esta etapa protege ainda mais a sonda e evita o acúmulo de detritos e plasma seco sobre a craniotomia, tornando a extração mais simples e segura. Tenha cuidado, pois trabalhar ao redor da sonda enquanto ela está abaixada pode causar quebra. 6. Cirurgia: Implantação da gaiola de Faraday Quando o cimento dentário estiver totalmente solidificado, afrouxe o suporte do microdrive afrouxando o parafuso lateral que fixa o acionamento com uma chave Allen (consulte a Figura 1 suplementar). Retraia suavemente o suporte em ~1 cm para que o microdrive fique independente, mas o amplificador/conector da sonda permaneça fixo ao suporte do implante sem esticar o cabo flexível. Coloque a coroa pré-fabricada e a malha de Faraday ao redor da placa de cabeça esticando a gaiola na abertura e encaixando-a sobre o microdrive e o cabo flexível horizontalmente e, em seguida, fixe-a na placa de cabeça com cimento dental.NOTA: Certifique-se de fechar todos os espaços entre a gaiola de Faraday e o crânio com cimento dental para proteger o implante contra contaminação. Coloque o anel da coroa de Faraday (consulte a Tabela de Materiais) com o conector da sonda/headstage sobre a coroa, alinhando o suporte integrado para a sonda ampmais vivo/conector com a área marcada por um ‘X’ recuado na coroa de Faraday (consulte a etapa 2.13). Prenda o anel à gaiola de Faraday com uma pequena gota de cola de cianoacrilato ou cimento dental em cada junção do anel do raio. Uma vez que o anel de Faraday com sonda integrada amplifier/conector estiver preso no lugar, retraia totalmente o braço estereotáxico com o suporte do microdrive. Consulte a Figura 3 suplementar para obter um guia passo a passo sobre a montagem desses componentes. 7. Gravação de teste pós-operatório Conecte o amplificador/conector da sonda ao hardware de gravação e inicie uma gravação. Se a sonda ainda não tiver atingido seu local de destino durante a inserção inicial (consulte a etapa 5.9), gire lentamente o parafuso do microdrive no sentido anti-horário para abaixar a sonda enquanto monitora os sinais neuronais.NOTA: Os sinais devem mudar a) quando os eletrodos tocam a camada de elastômero de silicone acima da craniotomia e b) quando os eletrodos começam a se mover para o cérebro (consulte a etapa 7.2). A atividade neuronal de alta frequência será registrada por eletrodos totalmente inseridos no cérebro, enquanto os eletrodos que estão em contato com o LCR na superfície do cérebro normalmente mostrarão um sinal de população neuronal filtrado de baixa passagem sem atividade de pico (semelhante a um traço de EEG), e os locais de registro no ar registrarão aumento do ruído elétrico. É possível verificar adicionalmente a profundidade de inserção da sonda medindo a impedância de canais individuais após a gravação do teste. Os canais em contato com o ar devem apresentar alta impedância (indicando um circuito aberto) e impedâncias como as medidas antes da cirurgia para os canais que tocam o LCR ou já estão no cérebro. Avance a sonda de silício a uma distância total máxima de aproximadamente 1000 μm por sessão, com uma velocidade máxima de aproximadamente 75 μm/min (consulte a etapa 5.5). Quando os potenciais de campo local neural forem visíveis na sonda e/ou a sonda estiver avançada em no máximo 1000 μm, termine a gravação de teste e desconecte o conector head-stage. 8. Recuperação Cubra a gaiola de Faraday com envoltório veterinário autoaderente (consulte a Tabela de Materiais). Finalize a anestesia e deixe o animal se recuperar por alguns dias seguindo as diretrizes experimentais aprovadas. Se os eletrodos na sonda de silício ainda não estiverem no local desejado, gire o parafuso do microdrive em pequenos passos com um máximo de quatro voltas completas (ou ~1000 μm) por sessão. Se necessário, repita este procedimento por vários dias até que o alvo seja alcançado. Recomenda-se combinar o movimento da sonda com registros simultâneos para avaliar a atividade eletrofisiológica em áreas transversalizadas. 9. Experimentos comportamentais e gravações crônicas Para gravações crônicas fixas na cabeça durante a execução da tarefa, prenda a placa de cabeça na base da gaiola de Faraday ao grampo de fixação da cabeça abrindo manualmente o grampo e prendendo a placa de cabeça implantada (consulte a Figura 1C, E, F).NOTA: Se a fixação da cabeça não for necessária, este sistema de implante também pode ser usado para gravações em movimento livre. Para gravações em movimento livre, pule as etapas 9.1 e 9.7. Remova o envoltório veterinário autoaderente do implante.NOTA: Para minimizar o desconforto para o animal, sugere-se que uma tarefa comportamental simples e gratificante seja iniciada antes desta etapa como uma distração enquanto o experimentador trabalha com o implante. Conecte o amplificador/conector ao equipamento de gravação. Realize gravações neuronais enquanto o animal executa a tarefa.NOTA: Se o objetivo é maximizar o número de unidades extracelulares registradas, mova o ônibus espacial em algumas dezenas de micrômetros sempre que o rendimento neural em um local diminuir. Observe que, depois de mover a sonda, o sinal pode levar de minutos a horas para se estabilizar. Portanto, pode ser benéfico mover a sonda no final de uma sessão para que o sinal possa se recuperar até o início da próxima sessão. Desconecte o equipamento de gravação e cubra o implante com um novo envoltório veterinário no final da gravação comportamental. Abra o grampo de fixação da cabeça para separar o animal da fixação da cabeça. 10. Recuperação da sonda No final da gravação final, retraia a sonda de silício o máximo possível no microdrive girando o parafuso no sentido horário. Faça isso enquanto o animal está com a cabeça fixa e se comportando ou com o animal anestesiado na configuração cirúrgica. Mapeie a saída da sonda do cérebro monitorando os sinais neuronais simultaneamente e verificando a assinatura dos eletrodos imersos no cérebro, tocando a superfície do cérebro ou em contato com o ar (consulte a etapa 7.3).NOTA: Dependendo do protocolo histológico e da sonda, as lesões eletrolíticas são realizadas antes de retrair a sonda para determinar a localização exata de alguns eletrodos na sonda. Se não for necessário monitorar a saída da sonda por meio de registro neuronal, também é possível retrair a sonda assim que o animal for terminado. Terminar o animal seguindo as diretrizes aprovadas (isso inclui perfundir o animal se estiver planejada a fixação do cérebro para histologia subsequente). Aguarde ~ 10 min após a morte do animal. Em seguida, fixe a cabeça do animal na estereotaxa, certificando-se de que a cabeça do animal não possa se mover durante o explante para evitar a quebra da sonda. Aplique uma gota de solução salina em cima da craniotomia e deixe de molho por alguns minutos para amolecer o tecido biológico seco na haste da sonda e diminuir a chance de quebra da haste. Coloque o suporte estereotáxico aproximadamente 0.5 cm acima do microdrive. Em seguida, corte a extremidade superior dos raios da gaiola de Faraday com uma pequena tesoura cirúrgica (consulte a Tabela de Materiais) para liberar o anel de Faraday que segura o amplificador/conector e transfira o anel de volta para os pinos verticais na parte superior do suporte estereotáxico (consulte a etapa 5.1 e a Figura Suplementar 1). Corte cuidadosamente a malha de cobre com a mesma tesoura cirúrgica, cortando áreas de malha em forma de U entre os raios da coroa de Faraday. Em seguida, corte os raios de plástico da coroa na base.NOTA: Evite dobrar os raios de plástico impressos enquanto eles estão sendo cortados, pois eles podem quebrar e enviar detritos de plástico voando em direção à sonda. Abaixe o suporte estereotáxico até que o microdrive possa ser fixado no suporte usando o parafuso lateral do suporte, fixe o microdrive e, em seguida, solte o parafuso T1 que conecta o corpo do microdrive à base do microdrive. Retraia lentamente o braço estereotáxico com o suporte do implante para levantar o microdrive de sua base. Certifique-se de que o microdrive se separe da base em um ângulo perpendicular (ou seja, ‘verticalmente’ da base).NOTA: Se o corpo e a base do microdrive não se separarem facilmente, verifique se o movimento do braço estereotáxico não está em um ângulo em comparação com a orientação do microdrive. Se necessário, o suporte e o microdrive são realinhados um ao outro, afrouxando levemente a fixação da cabeça do animal e reposicionando-a de acordo. O alinhamento correto é um dos aspectos cruciais para facilitar a recuperação do microdrive. Além disso, verifique se há algum cimento dentário residual conectando o microdrive e a base do microdrive (consulte a etapa 5.5). Nesse caso, o cimento é cuidadosamente raspado com bisturi e/ou broca dentária, dependendo da quantidade de cimento utilizada. Levante o braço estereotáxico com a sonda acoplada para criar espaço suficiente abaixo dele. Remova o animal da estereotaxa e prepare o cérebro seguindo um protocolo de histologia aprovado, se desejar. Recupere a base do microdrive implantada e limpe-a mergulhando-a em acetona por várias horas para reutilização posterior. Coloque uma base de microdrive limpa na massa adesiva (consulte a Tabela de Materiais), depois abaixe o microdrive na base e aperte o parafuso. Para evitar quebras, monitore a posição da sonda sob um microscópio durante todo o processo. Esta etapa pode ser concluída posteriormente se a base do microdrive implantado precisar ser limpa para reutilização primeiro.NOTA: Este protocolo exige o uso de massa adesiva como plataforma para a base, o que é vital, pois protege a base e, ao mesmo tempo, tem um grau de elasticidade, garantindo que a base não escorregue e colida com a sonda. A massa deve ser moldada em uma ‘face de penhasco’ vertical na lateral da base do microdrive onde a sonda será abaixada. Isso garante que, se a sonda for abaixada além da base, ela não entre em contato com a massa por baixo. A ‘torre’ da massa também deve ser alta o suficiente para que, se for abaixada além da base do microdrive, a sonda não entre em contato com a superfície da mesa na qual a massa é colocada. Por fim, prenda bem a massa na superfície para evitar que escorregue ou caia. Ao abaixar o microdrive na base do microdrive presa pela massa, certifique-se de um perfil lateral view do microscópio para monitorar o progresso para que, à medida que a sonda é abaixada, ela não colida com a base ou com a massa. Limpe e esterilize a sonda seguindo as instruções do fabricante. Para as sondas mais comumente disponíveis, mergulhe-as em um limpador enzimático (consulte a Tabela de Materiais) por 12 h, depois enxágue em água desmineralizada e higienize em álcool. Faça isso abaixando a sonda em um béquer grande contendo o limpador enzimático enquanto ainda estiver conectado ao suporte do microdrive no braço estereotáxico.NOTA: Se desejar, meça as impedâncias dos eletrodos na sonda após a limpeza para monitorar a degradação potencial de eletrodos individuais. Armazene o microdrive com a sonda limpa com segurança até o próximo experimento.