Traitement systémique des souris adultes postnatales, juvéniles et avortées par injection dans le sinus rétrobulbaire
Summary
Cet article fournit un protocole et une vidéo d’accompagnement pour l’injection dans le sinus rétrobulbaire jusqu’à un volume total de 150 μL pour les souris postnatales, juvéniles et adultes. Cette procédure est particulièrement bien adaptée à l’injection de petites souris (15 g) lorsque l’injection dans la veine de la queue n’est pas réalisable.
Abstract
Alors que les injections dans la veine de la queue sont fréquemment utilisées comme voie d’administration systémique chez les souris adultes, les injections rétrobulbaires sont une méthode alternative pour l’administration systémique avec moins de limitations. Tout d’abord, les injections dans la veine de la queue (IVT) sont limitées aux souris adultes où la taille de la veine de la queue est adaptée à l’accès. Être limité au traitement des souris adultes peut être problématique lorsqu’il s’agit de modèles de souris qui ne survivent pas jusqu’à l’âge adulte. Deuxièmement, les TVI ne sont pas réalisables pour les modèles murins avec des phénotypes de retard de croissance où les souris n’atteignent jamais la taille des souris adultes de type sauvage. Par conséquent, les injections rétrobulbaires peuvent être utilisées avec succès pour traiter les souris adultes jeunes et petites. Enfin, les injections rétrobulbaires sont effectuées sous anesthésie, ce qui est moins stressant pour les souris que les TVI qui sont généralement effectuées sans anesthésie. Cet article présente un protocole et des instructions détaillées pour les injections rétrobulbaires qui peuvent être utilisées pour l’administration systémique aux souris petites et jeunes.
Introduction
Des modèles murins de maladies génétiques sont couramment utilisés pour démontrer l’efficacité des thérapies à petites molécules, génétiques et cellulaires1. Chez la souris, la méthode la plus largement utilisée pour reproduire l’administration systémique à l’homme est l’injection dans la veine de la queue (IVT), qui est généralement effectuée chez les souris adultes à l’âge de 6 à 8 semaines environ pour s’assurer que la veine est suffisamment grande pour y accéder. TVI a été utilisé avec succès dans de nombreuses études précliniques de preuve de principe de maladies génétiques, telles que l’hémophilie, qui ont soutenu des essais cliniques humains pour la thérapie génique2. Cependant, de nombreux modèles murins de maladie génétique présentent des phénotypes de croissance et/ou de létalité précoce, ce qui les empêche d’atteindre l’âge ou la taille d’une souris adulte (figure 1). Le traitement de ces souris via TVI peut être extrêmement difficile, voire impossible, en fonction de l’âge de létalité et/ou de la taille maximale que les animaux peuvent atteindre.
En revanche, l’administration systémique d’un agent thérapeutique par injection rétrobulbaire dans le sinus (souvent et à tort appelée rétro-orbitaire) peut être effectuée assez facilement chez les souris, quel que soit leur âge ou leur taille3. Les injections rétrobulbaires de virus adéno-associé (AAV) ont été utilisées avec succès dans des modèles murins jeunes de maladies génétiques présentant un retard de croissance, tels que l’acidémie méthylmalonique (MMA) et la maladie de Niemann-Pick de type C 4,5,6,7,8. (Cette procédure peut également être utilisée pour injecter les nouveau-nés3, 4, 9, 10 ; cependant, cette technique n’est pas détaillée dans ce protocole ou dans la vidéo qui l’accompagne.) Même les substances hautement toxiques comme la doxorubicine peuvent être administrées en toute sécurité par injection rétrobulbaire11,12. Contrairement à l’ITV, les souris sont anesthésiées lors des injections du sinus rétrobulbaire, ce qui rend la procédure moins stressante pour la souris et plus facile pour l’opérateur qui n’a pas à retenir physiquement la souris13,14. Une autre préoccupation est que TVI utilise fréquemment une lampe chauffante pour dilater la veine de la queue, ce qui pourrait potentiellement provoquer une déshydratation chez les jeunes souris et pourrait être problématique dans les modèles murins de maladie génétique qui sont plus suspects au stress lié à la chaleur. Un autre problème qui peut survenir lors de l’utilisation de TVI est que la veine de la queue peut être particulièrement difficile à visualiser sur les souris très pigmentées. Cependant, comme l’IVT, les injections dans le sinus rétrobulbaire entraînent une large biodistribution systémique15,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que l’injection rétrobulbaire soit une méthode fiable pour administrer de petites molécules, des protéines et des thérapies génomiques, la pratique de la technique avec un colorant est nécessaire pour garantir une administration systémique fiable et reproductible. L’utilisation d’un colorant est fortement recommandée pour pratiquer les injections rétrobulbaires chez la souris avant d’utiliser cette voie d’administration dans des expériences. Les colorants peuvent être vérifiés visuellement dans les tissus de souris pour assurer une administration systémique constante.
Dans notre démonstration de la technique d’injection rétrobulbaire, du gaz isoflurane a été utilisé pour anesthésier les souris avant la procédure. D’autres formes d’anesthésie peuvent être utilisées avant la procédure, mais il est important de s’assurer que la souris ne se remet pas de la sédation avant la fin de l’injection. Heureusement, l’injection proprement dite prend généralement moins d’une minute et le temps pendant lequel la souris doit être complètement anesthésiée est bref. La souris doit être complètement sous sédation pendant l’injection, et l’anesthésie doit être réadministrée si la souris devient consciente avant l’injection. Comme il existe des risques associés à l’utilisation de l’anesthésie, la durée de la sédation de la souris doit être minimisée. Nous n’avons pas eu de problèmes avec l’utilisation de l’isoflurane pour calmer les petites souris malades souffrant d’acidémie méthylmalonique et propionique. Cependant, certains modèles de souris peuvent être plus sensibles à la sédation et à certaines anesthésies. Ce problème potentiel doit être pris en compte avant d’essayer d’utiliser la sédation dans une étude. Enfin, l’utilisation de la sédation en combinaison avec l’injection rétrobulbaire réduit considérablement la détresse apparente de la souris pendant le processus d’injection par rapport à l’IVT où la sédation n’est pas couramment utilisée.
Nous n’avons observé aucun problème lié à la post-injection, bien que l’infection soit un risque potentiel avec n’importe quelle injection. Pour réduire le risque d’infection, une seringue stérile à usage unique et un PBS stérile pour diluer l’AAV purifié sont utilisés. Toutes les souris de notre animalerie sont vérifiées quotidiennement pour détecter des signes de problèmes de santé potentiels et reçoivent des soins vétérinaires pour résoudre tout problème de santé lorsque cela est justifié.
L’alternative à l’injection dans le sinus rétrobulbaire et la méthode d’administration systémique la plus largement utilisée chez les souris juvéniles et adultes est l’IVT. L’injection dans le sinus rétrobulbaire et l’injection dans le sinus rétrobulbaire entraînent une biodistribution similaire dans le cas des petites molécules et des anticorps, et par extrapolation, on s’attendrait à la même chose pour les vecteurs viraux15,16. Cependant, aucun exemple comparant l’administration systémique de vecteurs de thérapie génique par TVI et l’injection dans le sinus rétrobulbaire n’a pu être trouvé dans la littérature. À notre avis, les injections dans le sinus rétrobulbaire sont plus faciles à réaliser chez les souris présentant un phénotype de croissance diminué et/ou une létalité précoce.
L’IVT est souvent considérée comme plus analogue à l’accouchement systémique chez l’homme, bien que les humains aient un sinus rétrobulbaire mais n’aient pas de queue. D’un côté, l’injection dans le sinus rétrobulbaire est comme l’administration systémique humaine en ce sens que l’injectant pénètre dans le système veineux supérieur de la même manière que si un injectant était délivré à un humain par un cathéter central inséré par voie périphérique (CCIP) ou un cathéter intraveineux placé dans le bras. À l’inverse, l’injectant pénètre dans le système veineux inférieur d’une souris après l’injection dans la veine de la queue. Malheureusement, aucune de ces méthodes ne reproduit exactement la ou les méthodes utilisées pour l’administration systémique chez l’homme, mais les deux sont des méthodes efficaces d’administration systémique chez la souris.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous apprécions l’aide du personnel de l’installation de souris du NHGRI, du laboratoire de pathologie moléculaire du NCI et surtout d’Andrew Warner. R.J.C. est soutenu par le programme de recherche intra-muros du NHGRI par le biais de 1ZIAHG200318-16 et ce travail a été partiellement financé par le National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS). La figure 2C a été créée avec BioRender.
Materials
| AAV8-CAG-eGFP | Univ. Penn. Vector Core | Special order | alternative sources of AAV reporters and alternative AAV reporters are available |
| Barrier (Filter) Tips, 20 μL size | ThermoFisher | AM12645 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Barrier (Filter) Tips, 100 μL size (sterile) | ThermoFisher | AM12648 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Dual Prodedure Circuit | VetEquip | 921400 | alternative anesthesia method can be used |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 pipette | Gilson | F123600 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Gilsen PIPETTEMAN Classic P100 pipette | Gilson | F123615 | for diluting AAV to disire injection volume and concentration |
| Hand warmers (HOTHANDS) | ULINE | S-1497B | to keep mouse warm while anesthesized |
| Insulin syringes, 31 G, 8 mm length, 3/10 mL capacity | Becton Dickson | 328438 | used in video; one syringe per injection |
| Isoflurane (Fluriso) | VETONE | 502017 | alternative anesthesia can be used |
| Medline Protection Plus Disposable Underpads | ThermoFisher | 23-666-062 | to place mouse on durring injection |
| Oak Ridge Phlebotomy Sharps Container With Transparent Lid | ThermoFisher | 22-730-434 | for needle disposal |
| Phosphate buffered saline PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | To dilute AAV to desired concencentration and volume |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes (sterile) | ThermoFisher | 3451 | for diluting AAV to disire injection volume and conentration |
| Sterile gauze sponge 4"x"4 | Covidien | 3033 | |
| Table-Top laboratory animal anesthesia system (LAAS) | VetEquip | 901806 | alternative anesthesia method can be used |
| Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%) | Ocenanside Pharmaceuticals | AK102D5DS | local anesthetic |
| Tuberculin syringe with a 27.0 G (or smaller) | Any | N/A | alternative to insulin syringe used in video |
| VetEquip’s User Guide and Operating Manual for table top and mobile Laboratory Animal Anesthesia System. | VetEquip | chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf | link to users guide and manual |
Riferimenti
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