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Biologia dello sviluppo

Les organoïdes de l’épithélium de surface de l’ovaire humain comme plate-forme pour étudier la régénération des tissus

Published: August 16, 2024
doi:
10.3791/66797
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1Department of Anatomy and Embryology,Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW),Leiden University Medical Center, 3Department of Obstetrics and Gynaecology,Amsterdam University Medical Center, 4Centre of Expertise on Gender Dysphoria,Amsterdam UMC, 5Amsterdam Reproduction and Development Research Institute, 6Department of Gynaecology,Leiden University Medical Center, 7Ghent-Fertility and Stem Cell Team (G-FAST), Department of Reproductive Medicine,Ghent University Hospital

Summary

Ce protocole décrit l’établissement d’organoïdes tissulaires tridimensionnels (3D) à partir de cellules primaires d’épithélium de surface ovarienne humaine (hOSE). Le protocole comprend l’isolement de l’hOSE à partir d’ovaires fraîchement collectés, l’expansion cellulaire de l’hOSE, les procédures de cryoconservation-décongélation et la dérivation d’organoïdes. L’immunofluorescence, l’analyse quantitative et la démonstration de l’utilité en tant que plate-forme de dépistage sont incluses.

Abstract

L’épithélium de surface de l’ovaire (OSE), la couche la plus externe de l’ovaire, subit une rupture lors de chaque ovulation et joue un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies ovariennes tout en restaurant l’intégrité ovarienne. De plus, l’OSE peut être à l’origine de cancers épithéliales de l’ovaire. Bien que les propriétés régénératrices d’OSE aient été bien étudiées chez la souris, la compréhension du mécanisme précis de réparation tissulaire dans l’ovaire humain reste entravée par l’accès limité aux ovaires humains et les protocoles de culture in vitro appropriés. Les organoïdes spécifiques aux tissus, des modèles in vitro miniaturisés reproduisant à la fois les aspects structurels et fonctionnels de l’organe d’origine, offrent de nouvelles possibilités pour l’étude de la physiologie des organes, la modélisation des maladies et les tests de médicaments.

Ici, nous décrivons une méthode pour isoler l’OSE humain primaire (hOSE) des ovaires entiers et établir des organoïdes hOSE. Nous incluons une caractérisation morphologique et cellulaire montrant une hétérogénéité entre donneurs. De plus, nous démontrons la capacité de cette méthode de culture à évaluer les effets hormonaux sur la croissance des organoïdes OSE sur une période de 2 semaines. Cette méthode peut permettre de découvrir des facteurs contribuant à la régénération de l’OSE et faciliter le dépistage de médicaments spécifiques au patient pour l’OSE malin.

Introduction

L’ovaire est considéré comme l’un des organes les plus dynamiques du corps, subissant des cycles constants de cicatrisation et de remodelage des plaies tout au long de la vie reproductive de l’individu. L’épithélium de surface ovarienne (OSE)1 est l’un des principaux acteurs impliqués dans la régénération du tissu ovarien après chaque cycle ovulatoire. L’OSE est une couche unique dérivée du mésothélium contenant des cellules épithéliales plates, cuboïdales et cylindriques qui recouvrent toute la surface ovarienne2. Avant l’ovulation, le tissu stromal ovarien à la surface du follicule ovulatoire subit une perturbation protéolytique pour permettre la libération du complexe cumulus-ovocytes. La zone blessée, connue sous le nom de stigmate ovulatoire, est ensuite réparée, avec une fermeture complète de la surface ovarienne obtenue en moins de 72 heures chez la souris3. La capacité très efficace de l’OSE à proliférer et à fermer la plaie ovulatoire met en évidence l’existence présumée d’une population de cellules souches résidentes4. En raison de la disponibilité limitée d’ovaires humains provenant de donneurs en âge de procréer, la plupart des connaissances sur les mécanismes de réparation de l’OSE proviennent de modèles animaux. Cependant, les caractéristiques spécifiques à l’espèce entravent la traduction de la recherche ovarienne sur les animaux à l’homme5.

Les études in vitro ont principalement utilisé la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) de l’OSE humain, où les cellules se sont développées en une monocouche attachée à la surface d’une plaque de culture, en raison de sa rentabilité et de sa facilité de culture 6,7,8. Néanmoins, cette approche présente des limites reproduisant la complexité de la dynamique du tissu ovarien9. À cet égard, les plateformes de culture cellulaire 3D avec un accent particulier sur les organoïdes ovariens ont révolutionné la rechercheovarienne 10. Les organoïdes tissulaires sont des représentations in vitro miniaturisées de l’organe dont ils sont dérivés, présentant une capacité d’auto-organisation 3D et imitant les fonctions et structures clés de leurs homologues in vivo 11. Cette technologie offre la possibilité de faire la lumière sur des questions fondamentales concernant le développement, la régénération et la réparation tissulaire de l’ovaire humain10. Au cours des dernières années, les chercheurs ont également appliqué les connaissances sur les organoïdes ovariens pour la génération d’organoïdes spécifiques au cancer de l’ovaire (CO) pour la modélisation des maladies et la médecine personnalisée 12,13,14.

Sur la base de différentes méthodes utilisées pour la génération d’organoïdes OSE de souris et d’organoïdes de trompes de Fallope (FT)15,16 ainsi que d’organoïdes OSE humains12 et d’organoïdes FT17, nous décrivons ici un protocole pour la dérivation d’organoïdes OSE humains à partir d’ovaires humains avec des applications potentielles dans les études de régénération OSE. Ce protocole isole efficacement les cellules primaires de l’OSE de l’ensemble des ovaires humains et comprend une description étape par étape de l’expansion cellulaire 2D et de la génération d’organoïdes hOSE 3D. Les organoïdes hOSE ont montré une variabilité (spécifique au donneur) dans la morphologie et la croissance, soulignant leur utilité pour des études personnalisées. De plus, ce protocole comprend l’entretien des organoïdes hOSE, le passage et l’immunofluorescence au sein de la même plaque de culture. De plus, il fournit une description des différentes morphologies que les organoïdes hOSE peuvent adopter et caractérise les changements d’immunophénotype au cours de la culture. Enfin, il met en évidence l’utilité en étudiant l’influence des signaux environnementaux, tels que les hormones ovariennes, sur la formation et la croissance des organoïdes hOSE en fonction du nombre et de la taille des organoïdes hOSE.

L’application de la technologie des organoïdes hOSE améliorera notre compréhension de l’ovaire, en mettant l’accent sur les mécanismes responsables de sa remarquable capacité de régénération. À mesure que les modèles ovariens humains en 3D continuent d’évoluer, la dépendance à l’égard des modèles animaux dans la recherche ovarienne diminuera, ce qui mènera à des thérapies innovantes dans le domaine de la médecine régénérative18.

Protocol

L’étude a été menée conformément aux lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki. Le plan de l’étude a été soumis au Comité d’éthique médicale du Centre médical de l’Université de Leiden (LUMC), et une lettre de non-objection a été obtenue (B18.029) avant l’étude. Le tissu ovarien humain primaire utilisé a été prélevé sur des personnes transmasculines subissant une chirurgie d’affirmation de genre à l’hôpital VUmc (Amsterdam, Pays-Bas). Un consentement éclairé signé a été obtenu de tous les donateurs. Tous les matériaux utilisés dans ce protocole sont répertoriés dans le tableau des matériaux. 1. Isolement des cellules primaires humaines de l’OSE Après une ovariectomie, placez les ovaires dans du NaCl à 0,9 % ou une solution saline stérile similaire et transportez-les au laboratoire sur de la glace. Transférez les ovaires individuels dans un tube conique de 50 mL contenant 2 à 3 mL de milieu de digestion (tableau 1) ou suffisamment pour couvrir l’ovaire.ATTENTION : Si l’ovaire n’est pas intact (une partie de l’organe a été coupée pour une analyse histologique), il est crucial de ne pas recouvrir cette partie avec le milieu de digestion. Placez le tube dans un bain de billes préchauffé (ou un bain-marie) à 37 °C pendant 30 min. Transvaser délicatement l’ovaire dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant 10 ml de milieu de prélèvement (tableau 1). Grattez doucement la surface ovarienne contenant les cellules hOSE à l’aide d’un grattoir cellulaire. Lavez le grattoir dans le support et répétez cette étape au moins trois fois (Figure 1).ATTENTION : Si l’ovaire n’est pas intact, évitez de gratter et d’immerger la zone endommagée pour minimiser la contamination par des types de cellules indésirables. Transvasez les cellules hOSE dans le milieu de collecte dans un tube de 15 ml. Faites tourner les cellules hOSE à 240 x g pendant 5 min.Si la pastille présente une couleur rouge, indiquant une contamination par des globules rouges (GR), remettez la pastille en suspension avec 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber pendant 3 min à température ambiante (RT) avec pipetage occasionnel, ajouter 4 mL de PBS avec du calcium et du magnésium (PBS+/+), et centrifuger à 240 x g pendant 5 min. Si la RBC persiste, répétez cette étape. Cryoconservez la pastille de cellules hOSE (section 2), utilisez-la pour la culture 2D (section 3) ou les organoïdes 3D (section 4) (figure 1). 2. Cryoconservation-décongélation des cellules hOSE CryoconservationRemettre en suspension la pastille de cellule hOSE dans 1 mL de produit de congélation de cellule. Transfert de suspension cellulaire dans des cryoflacons (2x cryoflacons par ovaire). Placez les cryoflacons dans un récipient de congélation et placez-le à -80 °C pendant la nuit. Transférez les cryoflacons congelés dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme. Décongélation:Retirez le flacon cryogénique de l’azote liquide. Placez le cryoflacon dans un bain de billes préchauffé (ou un bain-marie) à 37 °C pendant 5 minutes ou jusqu’à ce qu’il n’y ait qu’un petit noyau congelé visible à l’intérieur du cryoflacon. Pipeter la suspension de cellules hOSE dans un tube de 15 mL avec 10 mL de milieu collecteur (Tableau 1). Centrifugeuse à 240 x g pendant 5 min. Utilisez la pastille de cellules hOSE pour la culture 2D (section 3) ou les organoïdes 3D (section 4). 3. Culture hOSE 2D en monocouche Remettre la pastille hOSE en suspension dans 1 mL de OSE_2D milieu (tableau 1) et la transférer dans un puits à partir d’une plaque à 12 puits. Ajouter 1 mL de OSE_2D milieu supplémentaire dans le puits et cultiver à 37 °C dans un incubateur humidifié (5 % de CO2) pendant 72 h pour s’assurer que les cellules hOSE se fixent avant le premier changement de milieu. Actualisez le milieu tous les 2 à 3 jours jusqu’à ce que les cellules hOSE atteignent une confluence de 70 à 90 % (P0) (Figure 2A).REMARQUE : Si les globules rouges sont toujours présents dans la culture, ils seront éliminés lors du premier changement de milieu, et seules les cellules hOSE resteront attachées au puits. Pour passer les cellules hOSE, suivez les étapes décrites ci-dessous.Retirer le milieu de culture du puits. Laver avec 1 mL de PBS stérile. Retirez le PBS et ajoutez suffisamment de trypsine/EDTA à 0,05 % pour couvrir les cellules. Placez la plaque à 37 °C dans un incubateur humidifié (5 % de CO2) pendant 4 à 7 minutes jusqu’à ce que vous remarquiez que les cellules se rassemblent et se détachent du puits. Arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant 1 mL de milieu de collecte. Recueillir les cellules hOSE et centrifuger à 240 x g pendant 5 min. Semez les cellules dans un nouveau puits à la densité souhaitée, rafraîchissez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les cellules hOSE atteignent une confluence de 70 % à 90 %, et répétez l’étape 3.4.REMARQUE : Les cellules hOSE primaires peuvent être cultivées jusqu’à trois passages. Par la suite, la plupart des cellules deviendront sénescentes (Figure 2A). Utiliser les cellules hOSE expansées pour une caractérisation plus poussée à l’aide de l’immunofluorescence (figure 2B) afin de tester les effets des milieux de culture (figure 2C) ou des organoïdes 3D (section 4). 4. 3D culture d’organoïdes hOSE Préchauffer la lame à plusieurs puits à 37 °C. Comptez les cellules hOSE (fraîchement isolées ou cryoconservées-décongelées) à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou manuellement à l’aide d’un hémocytomètre. Remettre en suspension le nombre désiré de cellules hOSE dans 1 mL de milieu de base organoïde OSE glacé (tableau 1) dans un tube de 1,5 mL. Centrifugeuse à 240 x g pendant 5 min. Remettre en suspension la pastille hOSE dans la quantité souhaitée de solution d’extrait de membrane basale non diluée glacée (BME) pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 104 cellules/10 μL de BME. Pipeter la solution hOSE-BME vers le haut et vers le bas pour assurer une distribution homogène. Produire 10 μL de gouttelettes de solution hOSE-BME par puits dans la lame préchauffée à plusieurs chambres de puits.REMARQUE : Assurez-vous que chaque gouttelette est au centre du puits pour obtenir une forme de goutte. Placez la plaque avec les gouttelettes à l’envers à 37 °C dans un incubateur humidifié (5% CO2) pendant 15 min pour permettre la solidification du gel. Ajouter 100 μL de milieu OSE_3D (tableau 1) et faire cultiver à 37 °C dans un incubateur humidifié (5 % CO2). Rafraîchissez le milieu tous les 3-4 jours.REMARQUE : les organoïdes hOSE continuent de croître au moins jusqu’à 28 jours en culture (figure 3A, B), mais un passage tous les 14 à 28 jours (le taux de croissance dépend du donneur, frais ou cryo) est conseillé pour stimuler la prolifération cellulaire et la survie des organoïdes. Trois lignées organoïdes hOSE indépendantes ont été franchies au moins 4 fois sans signe de sénescence. Les organoïdes hOSE présentent des morphologies différentes (Figure 3C). Pour le passage d’organoïdes hOSE :Retirez le milieu et ajoutez 100 μL de DMEM/F12 avancé glacé dans chaque puits. Raclez le fond des puits à l’aide d’une pointe de pipette P1000 pour détacher les gouttelettes de gel. Transférez chaque gouttelette de gel flottante dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger les tubes avec les gouttelettes de gel à 240 x g pendant 5 min. Retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 300 μL de tampon de dissociation cellulaire et placez les tubes dans un bain de billes préchauffé (ou un bain-marie) à 37 °C pendant 5 à 10 min.REMARQUE : Si certains organoïdes restent intacts, pipetez de haut en bas à quelques reprises avec une pointe de pipette glacée recouverte de sérum de veau fœtal pour les perturber mécaniquement. L’enrobage des pointes de pipette avec du sérum fœtal bovin empêche les organoïdes de coller à la pointe. Ajouter 300 μL de milieu organoïde basique hOSE et centrifuger à 240 x g pendant 5 min. Remettez le granulé en suspension dans la quantité souhaitée de solution BME non diluée, réensemencez-les dans un rapport approprié (répartissez le contenu de 1 gouttelette en 1 à 4 gouttelettes) et cultivez comme mentionné ci-dessus.REMARQUE : Les organoïdes ne sont pas dissociés en cellules uniques et, par conséquent, les cellules ne peuvent pas être comptées avec précision pour un passage ultérieur. 5. Immunofluorescence à montage entier d’organoïdes 3D hOSE REMARQUE : L’immunofluorescence à montage entier peut être réalisée dans le même puits de culture (en gouttelettes) si vous utilisez des lames à chambres multiples adaptées aux techniques de microscopie. Fixez les organoïdes hOSE dans les gouttelettes de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pendant 20 min à RT. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min à RT sur une plate-forme rotative/agitée. Perméabiliser les organoïdes hOSE dans les gouttelettes à l’aide de 100 μL de tampon de perméabilisation (tableau 1) pendant 15 min à RT. Laver trois fois avec 100 μL de tampon de blocage (tableau 1) pendant 15 min à RT et bloquer toute la nuit (non/n) à 4 °C sur une plate-forme rotative/agitée. Incuber avec 100 μL de mélange d’anticorps primaires dilués dans un tampon de blocage à 4 °C o/n sur une plate-forme rotative/agitante.REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour une liste des anticorps primaires utilisés, le type de cellule marqué et le modèle animal utilisé pour valider l’expression 12,19,20,21,22,23,24,25. Amener la plaque à RT et la laver trois fois avec 100 μL de tampon de blocage pendant 15 min à RT sur une plate-forme rotative/agitante. Incuber avec 100 μL de mélange d’anticorps secondaires dilués dans un tampon de blocage pendant 2 h à RT sur une plate-forme rotative/agitée, mais à l’abri de la lumière.REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour une liste des anticorps secondaires utilisés. Pour vous protéger de la lumière, placez l’assiette dans une boîte sombre ou couvrez-la de papier d’aluminium. Laver trois fois dans 100 μL de PBS pendant 15 min à RT sur une plate-forme rotative/agitée. Conservez la plaque à 4 °C recouverte d’une feuille d’aluminium jusqu’à l’obtention d’une image (Figure 4). 6. Quantification de la taille de l’organoïde hOSE Prenez des photos en fond clair 10x (image TIFF) au microscope. Téléchargez et installez Fiji (https://imagej.net/software/fiji/)26. Mesurez la surface d’image des organoïdes hOSE avec le logiciel ImageJ Fidji :Chargez des fichiers TIFF d’image dans Fidji. Créez un seuil pour que le logiciel reconnaisse les organoïdes hOSE (zone plus sombre) dans l’image en fond clair téléchargée en cliquant sur Image > Ajuster > seuil. Ajustez les valeurs en dessous et au-dessus jusqu’à ce que la majeure partie de l’arrière-plan soit supprimée et que les organoïdes individuels soient conservés. Ouvrez l’outil ROI en cliquant sur Analyser > outil > ROI. Sélectionnez l’outil Baguette et cliquez sur la région avec un organoïde hOSE jusqu’à ce qu’une ligne jaune entoure tout le périmètre de l’organoïde apparaisse. Dans le panneau ROI, cliquez sur Ajouter et mesurer pour obtenir la valeur de surface de cet organoïde OSE. Répétez l’étape 6.3.4. pour chaque organoïde hOSE à mesurer.

Representative Results

Culture 2D hOSEDes cellules hOSE fraîchement isolées ont été plaquées sur une plaque à 12 puits et cultivées pendant 3 semaines. Au cours de cette période, les cellules ont été traversées trois fois (figure 2A). Les cellules hOSE primaires en culture présentaient une morphologie semblable à celle d’un pavé jusqu’au passage 3 (P3), mais ont ensuite commencé à montrer des signes de sénescence, conformément aux résultats précédents rapportant que la période limitée pendant laquelle hOSE peut être passée27. De plus, il a été démontré que l’OSE murin subit une transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT) in vitro, présentant des caractéristiques semblables à celles des fibroblastes telles que le réarrangement du cytosquelette d’actine et le dépôt de collagène I19. En accord, ACTA2+CD44+ hOSE a montré une régulation positive prononcée de COL1A1 entre P2 et P3 (Figure 2B), suggérant que les cellules hOSE subissent une EMT pendant la culture. La signalisation TGF-β est un régulateur majeur de l’EMT28 capable d’induire l’EMT dans divers types de cellules épithéliales29. Bien que le TGF-β n’ait pas été ajouté au milieu OSE_2D, le FBS ajouté pourrait contenir des niveaux détectables de cette cytokine30,31. Pour cette raison, nous avons testé si l’ajout du récepteur SB-431542, inhibiteur du TGF-β, pouvait prévenir l’EMT, permettant une culture 2D prolongée. Étonnamment, la supplémentation du milieu OSE_2D avec 10 μM de SB-43154232a entravé la prolifération cellulaire (Figure 2C). Nous avons conclu que la signalisation du TGF-β est essentielle à la prolifération de l’OSE, et d’autres expériences de culture 2D ont été réalisées sans l’inhibiteur. Culture d’organoïdes hOSE 3DSur la base des conditions de culture publiées pour la culture d’organoïdes OSE humains12, nous avons dérivé des organoïdes hOSE intégrés dans des gouttelettes de BME et cultivés dans OSE_3D milieu (contenant une concentration standard de 100 nM d’œstradiol) pendant une période allant jusqu’à 28 jours. En l’espace de 7 jours, de nombreux organoïdes hOSE dérivés de cellules OSE fraîchement isolées étaient kystiques avec un diamètre moyen de 130 mm (Figure 3A,B). Ces résultats étaient similaires à ceux rapportés par Kopper et ses collègues sur la dérivation des organoïdes hOSE à partir de tissu ovarien humain haché et digéré par voie enzymatique12. Il est intéressant de noter que les organoïdes hOSE dérivés de cellules OSE fraîchement isolées sont devenus plus grands (diamètre moyen de 160 mm) que les organoïdes hOSE issus de cellules OSE expansées 2D (diamètre moyen de 100 mm) après 14 jours de culture (Figure 3B), probablement en raison de la propension des cellules OSE expansées 2D à diminuer la prolifération. De plus, alors que de nombreux organoïdes hOSE 3D étaient constitués d’une monocouche de cellules épithéliales plates (figure 3C , panneau supérieur gauche), certains présentaient une monocouche cuboïde de cellules (figure 3C , panneau supérieur droit), d’autres étaient multicouches (figure 3C , panneau inférieur droit) ou formaient un amas de cellules non luménisées (figure 3C , panneau inférieur gauche). Pour tester si les organoïdes hOSE pouvaient également être dérivés à l’aide d’OSE_2D milieu, des cellules hOSE fraîchement isolées ont été intégrées dans des gouttelettes de BME et cultivées dans un milieu OSE_2D pendant 12 jours. Après 6 jours, des cellules fusiformes étaient visibles, suggérant que les cellules hOSE subissaient une EMT dans les gouttelettes. Il est important de noter qu’aucun organoïde hOSE n’a été formé à l’aide d’OSE_2D milieu (Figure 3D). Caractéristiques cellulaires des organoïdes hOSEDans l’ovaire adulte humain, la kératine 8 (KRT8) marque spécifiquement la population OSE (Figure 4A), et par conséquent, les organoïdes hOSE ont conservé l’expression de KRT8, validant leur identité cellulaire (Figure 4B). Dans les cellules OSE de souris, la localisation nucléaire de la protéine associée à Yes1 (YAP1) était spécifiquement associée aux cellules souches/progénitrices OSE capables d’étendre et de guérir la zone blessée après l’ovulation24,33. YAP a montré une localisation nucléaire dans la majorité des cellules des organoïdes hOSE, indépendamment de leur taille (Figure 4B). D’autres marqueurs signalés comme étant exprimés dans les cellules OSE de souris, tels que CD4420 et LGR522, ont également été étudiés. Il est intéressant de noter que CD44 et LGR5 étaient exprimés dans de petits organoïdes hOSE (<100 μm de diamètre), tandis que dans des organoïdes plus grands, CD44 et LGR5 semblaient régulés à la baisse (Figure 4B). Ensuite, nous avons cherché à savoir si les organoïdes hOSE présentaient la polarité apicale-basale généralement observée dans les organoïdes intégrés dans BME (apical-in)34. La protéine basolatérale intégrine bêta 1 (ITGB1) et la protéine apicale podocalyxine (PODXL) ont été utilisées pour montrer la polarité cellulaire dans les organoïdes hOSE, confirmant une polarité apicale claire indépendante de la taille de l’organoïde hOSE (Figure 4B). L’OSE humaine est connue pour exprimer le marqueur mésenchymateux N-cadhérine (CDH2), tandis que l’expression du marqueur épithélial E-cadhérine (CDH1) est limitée aux cellules OSE cylindriques (Figure 4A)2. Il est intéressant de noter que les organoïdes hOSE dérivés dans ce travail exprimaient les marqueurs mésenchymateux CDH2 et vimentine (VIM), et les grands organoïdes hOSE kystiques avec épithélium cuboïdal/cylindrique étaient à la fois CDH1+ et CDH2+VIM+ (Figure 4C). Il n’est pas clair si les organoïdes CDH1+ hOSE ont été dérivés de cellules primaires CDH1+ OSE ou de cellules CDH1- OSE qui ont subi une différenciation épithéliale ou une transformation (néoplasique) in vitro25,35. Présentation de l’utilisation des organoïdes hOSE : effet des signaux ovulatoires sur les organoïdes hOSELes hormones folliculo-stimulante et gonadotrophine chorionique humaine peuvent être utilisées pour induire la croissance folliculaire et l’ovulation, tandis qu’après l’ovulation, il y a une augmentation marquée de la concentration d’hormones produites par l’ovaire, telles que la progestérone et l’œstradiol36. Pour démontrer la facilité d’utilisation des organoïdes hOSE en tant que plate-forme de dépistage, nous avons examiné l’effet de ces hormones sur les organoïdes hOSE, en utilisant le nombre et la taille des organoïdes comme sortie de quantification (en utilisant Fidji). Pour cela, nous avons dérivé des organoïdes hOSE dans des milieux OSE_3D dépourvus d’œstradiol (sans hormone) et dans des milieux OSE_3D contenant de la FSH, de l’hCG, de l’œstradiol ou de la progestérone à différentes concentrations (Figure 5A). Le nombre d’organoïdes hOSE dérivés de cellules hOSE cryoconservées-décongelées (non expansées) provenant de 3 donneurs différents (n = 3) a été quantifié par gouttelette après 7 jours de culture (Figure 5A,B). Le milieu de culture a été changé tous les 3 jours. Aucune différence significative n’a été observée dans le nombre total d’organoïdes hOSE par gouttelette qui se sont formés dans les hormones contenant du milieu par rapport au milieu sans hormones (figures 5A, B). Pour quantifier l’effet des hormones sur la taille des organoïdes, après 14 jours de culture, chaque gouttelette (de chaque condition) a été imagée et la surface des 4 plus grands organoïdes hOSE a été mesurée à l’aide des Fidji. Il est intéressant de noter que la génération d’organoïdes hOSE à partir de deux donneurs différents (n = 2) en présence de progestérone (1000 nM) ou d’œstradiol (200 nM) a donné au moins un organoïde très grand (environ 700 μm de diamètre) par gouttelette (Figure 5C,D). Figure 1 : Représentation schématique de l’isolement des cellules hOSE à partir d’ovaires entiers. Les ovaires ont été incubés dans une solution de digestion pendant 30 min à 37 °C. Les cellules hOSE ont été détachées de la surface ovarienne par grattage doux, puis cryoconservées, directement plaquées sur une culture OSE 2D en monocouche, ou intégrées dans un extrait de membrane basale (BME) pour une culture organoïde hOSE 3D. Les cellules hOSE cryoconservées-décongelées peuvent être utilisées pour la culture 2D ou la formation d’organoïdes 3D, et les cellules hOSE étendues en 2D peuvent être utilisées pour générer des organoïdes hOSE 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Culture primaire 2D de cellules hOSE. (A) Images en fond clair des cellules hOSE aux passages 0 (P0), 2 (P2) et 3 (P3) illustrant la morphologie typique des pavés épithéliaux. Les barres d’échelle sont de 750 μm sur les panneaux supérieurs et de 125 μm sur les panneaux inférieurs. (B) Immunofluorescence pour ACTA2, CD44, COL1A1 sur des cellules hOSE 2D à P2 et P3. Les barres d’échelle mesurent 50 μm. (C) Images en fond clair de cellules hOSE cultivées avec 10 μM de SB-431542 à P0, P2 et P3. Les cellules ont montré des signes de sénescence à partir de P2 et n’ont pas atteint une confluence élevée pendant la culture. Les barres d’échelle sont de 750 μm sur les panneaux supérieurs et de 125 μm sur les panneaux inférieurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Caractérisation morphologique des organoïdes hOSE. (A) Images en fond clair de trois dérivations indépendantes d’organoïdes hOSE provenant de trois donneurs différents (tOVA86, tOVA87, tOVA88). Les images ont été prises après l’intégration cellulaire (J0), le jour 7 (J7), le jour 14 (J14) et le jour 28 (J28) de la culture. Les barres d’échelle sont de 750 μm à D0 et de 50 μm pour le reste. (B) Diamètre des organoïdes hOSE dérivés de cellules hOSE fraîchement isolées (ligne pointillée) et de cellules hOSE 2D expansées (ligne continue). La représentation est la taille moyenne ± l’écart-type mesurés à D0, D7 et D14. Les résultats de deux donneurs différents (tOVA88 et tOVA89) sont présentés. (C) Images en fond clair d’organoïdes hOSE montrant différentes morphologies : couche plate unique (en haut à gauche), couche colonnaire unique (en haut à droite), multicouche (en bas à droite) et agrégat de cellules non lumenisées (en bas à gauche). Les barres d’échelle mesurent 100 μm. (D) Images en fond clair de cellules hOSE intégrées dans BME et cultivées pendant 12 jours avec des milieux OSE_2D. Les images ont été prises après l’intégration cellulaire (J0), le jour 6 (J6), le jour 9 (J9) et le jour 12 (J12). Les cellules de type fibroblaste ont dépassé la culture et aucune structure de type organoïde n’a été formée. Les barres d’échelle mesurent 750 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4 : Caractérisation cellulaire des organoïdes hOSE. (A) Immunofluorescence pour KRT8 et CDH1 dans la coupe ovarienne humaine. La barre d’échelle sur le panneau de gauche est de 500 μm, et les panneaux du milieu et de droite sont de 50 μm. (B) Immunofluorescence pour KRT8 et YAP, LGR5 et CD44, et ITGB1 et PODXL dans les organoïdes hOSE de différentes tailles (100 μm). Les barres d’échelle sont de 50 μm. (C) Immunofluorescence pour VIM, CDH1, CDH2 dans les organoïdes hOSE. Les barres d’échelle mesurent 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5 : Effet des signaux ovulatoires sur la formation des organoïdes hOSE. (A) Nombre total d’organoïdes hOSE par gouttelette formée au jour 7 dans différents milieux de culture. Les organoïdes hOSE ont été dérivés de trois donneurs différents (tOVA77, tOVA79, tOVA83). En gras est le milieu OSE_3D utilisé pour la dérivation des organoïdes. (B) Formation relative d’organoïdes par rapport à un milieu sans hormones. Les valeurs regroupées des organoïdes hOSE ont été dérivées de trois donneurs différents (tOVA77, tOVA79, tOVA83). (C) Graphique illustrant la zone d’image des 4 plus grands organoïdes hOSE au jour 14 dans chacune des conditions expérimentales testées à partir de deux donneurs différents (tOVA77, tOVA83). (D) Images en fond clair montrant des organoïdes hOSE au jour 14 de culture avec un milieu sans hormones, 200 nM E2 et 1000 nM P4 de deux donneurs différents (tOVA77, tOVA83). Les barres d’échelle mesurent 750 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Tableau 1 : Composition des solutions de travail utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

La technologie des organoïdes 3D s’impose comme un outil indispensable à la recherche médicale. D’une part, cette plateforme in vitro offre la possibilité d’étudier des questions mécanistes fondamentales sur la régénération tissulaire, la cicatrisation des plaies et le développement18. D’autre part, les organoïdes 3D dérivés d’échantillons de patients permettent des études de médecine personnalisées, y compris des diagnostics, des tests de médicaments et la thérapie cellulaire 12,13,14,37,38. Dans le domaine de la recherche ovarienne, l’hOSE a suscité un intérêt considérable depuis son implication comme origine des carcinomes épithéliales de l’ovaire39. Bien que l’on pense que la plupart des carcinomes séreux de l’ovaire de haut grade (HGSOC), l’un des cancers épithéliales de l’ovaire les plus courants, proviennent des trompes de Fallope40, les recherches actuelles sur les organoïdes ovariens 3D de souris ont proposé une double origine potentielle de HGSOC à partir de l’OSE et des trompes de Fallope 15,16.

Ici, nous avons décrit un protocole pour la dérivation d’organoïdes 3D hOSE et décrit son application pour apporter de nouvelles connaissances mécanistes dans la régénération du tissu ovarien. Ce protocole comprend une méthode étape par étape pour isoler les cellules hOSE primaires des ovaires humains et générer des organoïdes hOSE 3D. Pour assurer une dérivation efficace des organoïdes hOSE, il est crucial de minimiser la manipulation ovarienne. En raison de son emplacement sur la surface de l’ovaire et de son organisation monocouche, le hOSE est sujet à des dommages et à une perte lors de l’ovariectomie et de la manipulation des organes. Pour cette raison, nous avons privilégié une méthode enzymatique et de grattage appliquée sur l’ensemble de l’ovaire pour isoler hOSE 2,8. Dans le protocole actuel, un traitement enzymatique léger a été appliqué pour perturber les connexions intercellulaires hOSE, suivi d’un léger grattage de la surface ovarienne.

En comparant la culture 2D avec la culture 3D hOSE, il est important de noter que malgré le taux de prolifération initial élevé des cellules hOSE dans la culture 2D, leurs caractéristiques cellulaires ont changé en raison de l’EMT, suggérant que les conditions de culture 2D appliquées ne sont pas appropriées pour maintenir une morphologie épithéliale. En revanche, les organoïdes 3D hOSE ont pu être passés au moins 4 fois sans signes de sénescence. Le OSE_3D milieux de culture organoïdes utilisés était basé sur celui utilisé par Kopper et ses collègues pour la dérivation des organoïdes CO et hOSE sains12 et par Kessler et ses collègues pour la dérivation des organoïdes FT humains17. La principale différence était le remplacement des milieux conditionnés par Wnt3a et R-Spondin-1 humains par des protéines recombinantes disponibles dans le commerce pour faciliter la reproductibilité.

Les techniques d’immunofluorescence consistent généralement à retirer l’échantillon de tissu de la plaque de culture et à le traiter pour une paraffine ou une cryo-section. Lorsque l’on travaille avec de très petites structures, le risque de les perdre lors du traitement des échantillons est élevé. Dans ce protocole, la dérivation des organoïdes hOSE s’effectue dans des plaques de culture cellulaire qui permettent une imagerie par microscopie directe sans qu’il soit nécessaire de retirer les organoïdes hOSE de la matrice BME. De plus, la méthode d’immunofluorescence à monture entière utilisée ici, décrite par Rezanejad et ses collègues pour les organoïdes canalaires pancréatiques41, a permis d’observer in situ la localisation des protéines dans des organoïdes morphologiquement intacts. Nous avons démontré que, lors de la réalisation de ce protocole d’immunofluorescence sur des organoïdes hOSE dérivés de lames à plusieurs chambres de puits, il y a une pénétration d’anticorps très efficace avec un signal de fond très faible.

Bien que la plupart des organoïdes hOSE dérivés à l’aide de cette méthode n’aient pas d’expression de CDH1, certains organoïdes hOSE CDH1+ se sont formés, atteignant des tailles plus grandes par rapport aux organoïdes CDH1-hOSE. L’expression de CDH1 a été associée aux phénotypesnéoplasiques hOSE 2,35. Les ovaires utilisés pour l’isolement de l’hOSE ont été donnés par des donneurs transmasculins sains en âge de procréer (27,1 ± 5 ans). Ces donneuses ont été sous traitement à la testostérone pendant une période de 38 ± 15 mois avant l’ovariectomie. Nous ne pouvons pas écarter la possibilité que les cellules CDH1+ hOSE à la surface de l’ovaire puissent être attribuées au traitement à la testostérone. Bien que le traitement aux androgènes ait été associé à des modifications ovarienne, telles que l’anovulation42, l’hyperplasie de la zone corticale43 et l’augmentation de la rigidité corticale44, la pathologie ovarienne générale reste bénigne lors de l’utilisation de la testostérone45.

En résumé, ce protocole met en évidence le potentiel de la génération d’organoïdes 3D hOSE pour décoder les questions mécanistes sur la régénération du tissu ovarien. Il est important de noter que cette méthode pourrait également être appliquée pour la détection des cellules malignes présentes dans les biopsies ovariennes de patientes à risque de développer un cancer. Collectivement, cette méthode soutient les applications potentielles de cette plateforme in vitro innovante pour les études fondamentales de la fonction ovarienne et les applications cliniques pour les traitements médicaux individualisés.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier tous les patients qui ont fait don de tissus pour cette étude, les membres du groupe Chuva de Sousa Lopes pour les discussions utiles, et I. De Poorter pour la conception des caricatures utilisées dans la figure 1. Cette recherche a été financée par le Conseil européen de la recherche, numéro de subvention ERC-CoG-2016-725722 (OVOGROWTH) pour J.S.D.V. et S.M.C.d.S.L. ; et la Fondation Novo Nordisk (reNEW), numéro de subvention NNF21CC0073729 pour J.S.D.V. et S.M.C.d.S.L.

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Invitrogen 25200-056
12-well Culture Plate Corning 3336 Sterile
15 mL tubes Greiner 188271 Sterile
28cm Cell Scraper Greiner Bio-One 541070
50 mL tubes Greiner 227261 Sterile
60 mm Petri dish Greiner Bio-One 628160
A83-01 Stem Cell Technologies 72024
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B27 supplement (50x) ThermoFisher Scientific 17504-044
Bead bath M714
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich 10735086001
Cell Dissociation Buffer ThermoFisher Scientific 13151014
Cryo-container "Mr. Frosty" BD Falcom 479-3200
DMEM Medium ThermoFisher Scientific 41966-029
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen  A-21447
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488  Invitrogen  A-21202
Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 647 Invitrogen A-31571
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  Invitrogen A-21206
Donkey anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 594  Invitrogen  A-21207
Donkey anti-Sheep IgG Alexa Flour 647  Invitrogen  A-21448
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher Scientific A4736401
Follicle Stimulating Hormone (FSH) Sigma Aldrich F4021
Forskolin  Peprotech 6652995
Glutamax (100x) Gibco 35050-038
Goat anti-CDH2 (N/R-cadherin) Santa Cruz  SC-1502 Mesenchymal Cells; Wong et al 1999 (human)25
Goat anti-PODXL (podocalyxin of GP135) R&D Systems  AF1658 Apical Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 555 Invitrogen A-21434
hEGF R&D Systems 263-EG
HEPES Gibco 15630-056
Hydrocortisone Sigma Aldrich H0888
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS-X; 100x) ThermoFisher Scientific 51500-056
Liberase DH Research Grade Sigma Aldrich A4736401
Luna-II  cell counter Logos Biosystems L40001
Matrigel Sigma Aldrich 354277
McCoy’s 5A Medium  ThermoFisher Scientific 26600-023
Mouse anti-ITGB1 (integrin beta 1) Santa Cruz  SC-53711 Basolateral Polarity; Bryant et al 2014 (canine)21
Mouse anti-KRT8 (cytokeratin 8) Santa Cruz  SC-101459 OSE Cells; Kopper et al 2019 (human)12
Mouse anti-VIM (vimentin) Abcam  AB0809 Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Mycozap Plus-CL Lonza V2A-2011
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G
OVITRELLE-Choriogonadotropin alfa (hCG) Merk G03GA08
Progesterone (P4) Sigma Aldrich P8783
Rabbit anti-ACTA2 (alpha smooth muscle actin) Abcam  AB5694 Mesenchymal Cells; Abedini et al 2020 (mouse)19
Rabbit anti-CDH1 (E-cadherin) Cell Signaling  CST 3195S Epithelial Cells; Wong et al 1999 (human)25
Rabbit anti-LGR5 Abcam  AB75850 OSE Progenitor Cells; Flesken-Nikitin et al 2013 (mouse)22
Rabbit anti-YAP Cell Signaling  14074S Proliferative OSE; Wang et al 2022 (mouse)24
Rat anti-CD44 PE-conjugated eBioscience 12-0441-81 OSE Progenitor Cells; Bowen et al 2009 (human)20
Recombinant Human Heregulinβ-1 Peprotech 100-03
Recombinant Human Noggin Peprotech 120-10C
Recombinant Human Wnt3a R&D Systems 5036-WN-010
Recombinant Rspondin-1   Peprotech 120-38
Red blood cells lysis buffer eBiosciences 00-4333-57
Revitacell Supplement (100x) ThermoFisher Scientific A26445-01
RNAse free DNAse Qiagen 79254
SB-431542 Tocris Bioscience 1624/10
Sheep anti-COL1A1 (pro-collagen 1 alpha 1) R&D Systems  AF6220 Mesenchymal Cells; Hosper et al 2013 (human)23
Y-27632  StemCell Technologies 72304
β-Estradiol (E2) Sigma-Aldrich E8875
μ-Slide 18-well culture plate Ibidi 8181 Sterile
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Riferimenti

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Del Valle, J. S., Husetic, A., Diek, D., Rutgers, L. F., Asseler, J. D., Metzemaekers, J., van Mello, N. M., Chuva de Sousa Lopes, S. M. Human Ovarian Surface Epithelium Organoids as a Platform to Study Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (210), e66797, doi:10.3791/66797 (2024).
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