Оптимизированная и стандартизированная процедура получения высококачественных аденоассоциированных вирусных векторов с высоким титром с использованием платформы клеточной фабрики

Подробная информация о реагентах, плазмидах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в таблице материалов. Состав используемых буферов приведен в Дополнительном файле 1. 1. Плазмидный препарат Трансформация плазмид (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) в кишечной палочке.ПРИМЕЧАНИЕ: Любой штамм E.coli может быть использован для амплификации плазмид. Для некоторых плазмид специальные компетентные клетки, такие как NEB stable, могут улучшить выход плазмид. В этом протоколе используются три плазмиды: pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 и pAAV-Cap: pAAV-RC6. Выращивайте бактерии в средах LB, содержащих соответствующие селективные антибиотики, в оптимальном объеме при 37 °C в течение 16-18 часов.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании стабильных клеток NEB культивируйте при 30 °C в течение 18-20 часов. Соберите плазмидную ДНК путем центрифугирования кишечной палочки. питательная среда при 4000 x g, 4 °C, в течение 15 мин. Осторожно перелейте надосадочную жидкость из бутылки центрифуги в контейнер для отходов и очистите плазмидную ДНК из гранулы с помощью набора для очистки плазмид без эндотоксинов.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы наливаете его медленно и избегайте разбрызгивания. Измерьте концентрацию и чистоту ДНК с помощью спектрофотометра.ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте чистоту ДНК, проверив соотношение OD260/OD 280 . Соотношение для чистой ДНК составляет около 1,8. Концентрация ДНК должна быть выше 1 г/л для более поздней стадии котрансфекции. Сделайте запасы бактериального глицерина, добавив 500 мкл ночной культуры к 500 мкл 50% глицерина в криовиале и храните при -80 °C. 2. Подготовка HEK293T клеток Засейте HEK293T клетки с помощью среды с высоким содержанием глюкозы DMEM, содержащей 10% FBS, в 10-слойную клеточную фабрику (CF10) и дайте клеткам вырасти в инкубаторе в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Проходы ячеек 293T должны быть меньше 10, чтобы обеспечить оптимальные условия для надежного производства AAV. По возможности не добавляйте антибиотики в питательные среды в это время. CF10 имеет примерно в 42 раза большую площадь поверхности роста по сравнению с 150-миллиметровой чашкой для клеточных культур. Засейте клетки той же плотности в чашке для клеточных культур диаметром 150 мм, чтобы можно было проверить рост клеток под микроскопом. Приготовьте 1075 мл клеточной суспензии, добавьте 25 мл клеточной суспензии в чашку диаметром 150 мм, а оставшуюся часть добавьте в CF10. Проверьте слияние клеток на следующий день перед трансфекцией.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны достичь 80%-90% конфлюенции во время трансфекции при наблюдении под микроскопом. 3. Трехкратная трансфекция плазмид AAV Рассчитайте необходимое количество каждой плазмиды (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-серотип), чтобы иметь молярное соотношение 1,2:1:1 с 2,5-5 мг общей ДНК на CF10.ПРИМЕЧАНИЕ: Молярное соотношение трех плазмид может варьироваться для оптимальной эффективности трансфекции. Лучше протестировать его в небольших условиях, прежде чем переходить к этой настройке CF10. В качестве примера для создания вируса AAV6-CMV-GFP используются pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 и pAAV-RC6. Формула калькулятора PEI приведена в таблице 1. Добавьте 350 мл OptiMEM в стерильный флакон объемом 500 мл. Добавьте все три плазмидные ДНК во флакон с Opti-MEM. Хорошо перемешайте. Добавьте 15 мл раствора полиэтиленимина (ПЭИ) 1 мг/мл (соотношение 1:3 мкг ДНК к мкг ПЭИ). Энергично встряхивайте смесь OptiMEM/ДНК/PEI вверх и вниз в течение 30 с.ПРИМЕЧАНИЕ: Делать пузыри – это нормально. Выдержать смесь при комнатной температуре в течение 10-15 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительная инкубация может снизить эффективность трансфекции. Добавьте раствор OptiMEM/DNA/PEI во флакон объемом 1 л, содержащий 700 мл DMEM с низким содержанием глюкозы с 10 мМ HEPES и 2% FBS. Хорошо перемешайте.ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании низкий уровень глюкозы в DMEM показал лучшую продукцию вектора AAV после ко-трансфекции. Добавление HEPES помогает поддерживать клетки в лучшем состоянии. Перемешивайте, медленно вращая бутылку. Избегайте создания слишком большого количества пузырей. Извлеките CF10 из инкубатора и высосьте среду в контейнер для отходов.ПРИМЕЧАНИЕ: Положите CF10 на поверхность внутри вытяжки и постепенно поднимайте одну сторону вверх, медленно пылесосьте среду, не отсоединяя элементы. Осторожно добавьте трансфектантную смесь в CF10. Убедитесь, что все десять слоев покрыты средой.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 25 мл трансфектирующей смеси в чашку диаметром 150 мм. Следите за клетками ежедневно до сбора урожая. Добавьте оставшуюся трансфективную смесь в CF10, медленно выливая. Вращайте CF10 очень осторожно и обеспечьте одинаковый объем для каждого слоя. Верните CF10 в инкубатор на 72-96 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте 150-миллиметровую мониторную тарелку, чтобы решить, когда следует собирать векторы AAV. Когда клетки становятся очень легко отделяющимися при полной загрузке AAV, наступает время сбора урожая. 4. Сбор векторов AAV Извлеките вирус через 3-4 дня после перефикации, энергично встряхивая CF10. Налейте среду в конические пробирки объемом 250 мл и раскрутите вирус при 4000 x g в течение 20 минут при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Для серотипа AAV6, используемого в этом протоколе, 80% AAV будет оставаться в основном связанным с клеточным материалом в грануле. А 20% AAV были выделены в СМИ. Эти пропорции могут отличаться для других серотипов AAV. Фильтруйте осветленную надосадочную жидкость с фильтрующей установкой 0,45 мкм и сохраните ее для осадков. Промойте CF10 500 мл буфера DPBS 1x и центрифугируйте при 4000 x g в течение 20 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью вакуумной системы и аспирационной пипетки. Добавьте 20 мл буфера для лизиса AAV на CF10 при -80 °C до очистки.ПРИМЕЧАНИЕ: Перенесите лизат AAV в коническую пробирку объемом 50 мл для последующей экстракции AAV. Выньте отфильтрованную надосадочную жидкость, добавьте 40% раствор PEG-2,5 M NaCl до конечной концентрации 8% PEG и инкубируйте в холодном помещении на орбитальном ротаторе не менее 3 часов или на ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: Для 100 мл надосадочной жидкости добавьте 25 мл 40% раствора PEG-2,5 М NaCl. Осадите вирус путем центрифугирования при 4000 x g в течение 30 мин при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите смесь в конические пробирки объемом 250 мл для центрифугирования. Аспират для удаления надосадочной жидкости и добавьте 5-10 мл буфера для ресуспензии AAV HEPES для суспензии гранул. Переложите в коническую пробирку объемом 50 мл для продолжения очистки или храните при температуре -80 °C. 5. Добыча AAV Разморозьте вирусную гранулу на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут с помощью шейкера.ПРИМЕЧАНИЕ: Вихревой перегрузите лизат AAV до полного плавления. Заморозьте в ванне с 100% этанолом -80 °C в течение 20-30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, цикл заморозки может быть выполнен с помощью холодного стакана из 100% этанола, окруженного сухим льдом. Выполните замораживание/размораживание 3-4 раза, а между ними при необходимости сделайте вихрь.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот цикл можно приостановить на этапе заморозки. Храните лизат AAV при температуре -80 °C до начала последующей работы. Разморозьте лизат AAV (с шага 5.3) и ресуспендированный AAV (с шага 4.7)» на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут с помощью шейкера и сделайте вихрь.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что он полностью растаял, и перемешайте. Добавьте бензоназную нуклеазу (250 единиц/μл) к лизату AAV и ресуспендируйте AAV до конечной концентрации 50 единиц/мл. Вихревой раствор. Выдерживать на водяной бане при температуре 37 °C с встряхиванием в течение 30 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Достаньте 10% аликвоты дезоксихолата натрия на водяной бане, чтобы дать время раствориться, нагрейте и тщательно перемешайте. Добавьте 10% дезоксихолат натрия до конечной концентрации 0,5% и выдерживайте при 37 °C при включенном шейкере в течение 30 минут.Примечание: Дезоксихолат натрия использовался для усиления высвобождения AAV из клеток. Распределите исходный раствор AAV по центрифужным пробиркам объемом 2 мл и центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пипетку объемом 1 мл для переноса надосадочной жидкости. Выбросьте гранулы. Добавьте равное количество хлороформа и извлеките AAV путем вортексирования в течение 1-2 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор должен стать непрозрачным, белым, молочным. Перелейте молочный раствор в центрифужные пробирки объемом 2 мл и равномерно распределите. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Аккуратно извлеките верхний розовый слой пипеткой и переложите его в новую коническую пробирку объемом 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Не нарушайте слои хлороформа/белка. Измерьте окончательный объем с помощью пипетки. В соответствии с диаграммой объема первичных AAV-PEG-сульфатов (Таблица 2) смешайте соответствующие объемы 50% (NH4)2SO4 и 40% раствор PEG. Вихрь в течение 2 мин. Переложите смесь в центрифужные пробирки объемом 2 мл для равномерного распределения. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 мин при 4 °C Соберите нижний слой с помощью иглы 22 G и шприца объемом 3 мл. Соберите AAV в коническую пробирку объемом 50 мл и храните ее при температуре 4 °C для последующего ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола. 6. Очистка AAV методом йодиксанолового градиентного ультрацентрифугирования Приготовьте йодиксаноловые градиенты перед загрузкой AAV в соответствии с количеством используемых ультрацентрифугирующих пробирок (Таблица 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Для наблюдения за слоями использовался феноловый красный. Медленно переложите каждый раствор в полипропиленовую ультрацентрифужную пробирку с круглым верхом с быстрым запайкой с помощью шприца объемом 10 мл, прикрепленного к длинной игле 16 G. Избегайте образования пузырей. Осторожно добавьте до 17 мл раствора AAV поверх градиента с помощью шприца 22 G. Используйте диализный буфер AAV, чтобы долить трубку.ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте раствор AAV, загрузив капли в стену в ультрацентрифужную пробирку. Не нарушайте слои с градиентом. Запечатайте ультрацентрифужные пробирки с помощью электрического запайщика.ПРИМЕЧАНИЕ: Сбалансируйте пробирки перед отправкой в ультрацентрифугу с разницей в ±0,2 г. Центрифуга при давлении 350 000 x g в течение 2 ч в роторе Ti70 при 4 °C. Осторожно снимите пробирки с ротора и поместите их в штатив для ультрацентрифужных пробирок.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что градиенты не нарушены. Соберите фракции AAV, выполнив следующие действия:Стабилизируйте трубку на держателе подставки. Проколите ультрацентрифужные пробирки немного ниже границы раздела 40%-60% с помощью иглы 19 G, прикрепленной к шприцу объемом 10 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие иглы должно быть направлено вверх, лицом к 40% градиенту. Проделайте отверстие в верхней части трубки иглой 16 G. Соберите до 5 мл на пробирку. Избегайте скопления белковых загрязнений на границе раздела 25%-40%. Повторите для каждой ультрацентрифужной пробирки.ПРИМЕЧАНИЕ: Переложите фракции AAV в коническую пробирку объемом 50 мл. 7. Второй раунд ультрацентрифугирования йодиксаноловыми градиентами ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является обязательным. Этот шаг направлен на уменьшение коэффициента пустого AAV для получения более качественного полного AAV-капсида. Разбавьте AAV >1:1 с помощью диализного буфера AAV.ПРИМЕЧАНИЕ: AAV, собранный в ходе первого раунда ультрацентрифугирования, содержал 40% слой йодиксанола. Он должен быть разбавлен не менее чем на 50%, чтобы его можно было загрузить поверх 30% слоя йодиксанола. Выложите каждый раствор (Таблица 4) в ультрацентрифугирующую пробирку с помощью иглы 16 G и медленно прикрепите шприц объемом 10 мл. Избегайте образования пузырей. Осторожно добавьте 20 мл разбавленного раствора AAV поверх градиента с помощью шприца 22 G. Используйте диализный буфер AAV, чтобы долить трубку. Повторите шаги с 6.4 по 6.7. 8. Диализ и концентрация AAV Перенесите вирус AAV в диализную кассету с помощью новой иглы 18 G и шприца объемом 10 мл. Медленно вводите вирус в кассету и удаляйте из нее воздух. Добавьте полосу для перемешивания в стакан с диализным буфером AAV и поместите его на тарелку для перемешивания. Поместите диализную кассету в диализный буфер с помощью поплавкового буя. Перемешайте при 4 °C. Замените диализный буфер AAV 2-3 раза.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте достаточный буфер, чтобы позволить кассете плавать и выполнить замену буфера. Накройте стакан алюминиевой фольгой. С помощью шприца объемом 10 мл, прикрепленного к игле 18 G, соберите вирус из кассеты в центробежный фильтрующий блок. Центрифуга при 4 000 x g в течение 15-30 мин при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Промойте AAV диализным буфером AAV 2-3 раза. Концентрируйте AAV до тех пор, пока ~200 мкл оставшегося количества не окажется на поверхности фильтра. Соберите концентрированный AAV из фильтрующего блока. Промойте фильтр еще 300 мкл диализного буфера AAV и перенесите его в концентрированный AAV. Отфильтруйте вирус через шприц-фильтр 0,22 мкм с помощью туберкулинового шприца с люэровским скольжением объемом 1 мл. Чтобы обеспечить наименьшую потерю объема, с помощью шприца объемом 10 мл протолкните воздух через фильтр 2-3 раза. Храните очищенный вирус AAV при температуре 4 °C временно для титрования.ПРИМЕЧАНИЕ: Титруйте вирус, аликвоту, и храните при температуре -80 °C в течение 1 недели. 9. Титрование вируса AAV ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная полимеразная цепная реакция TaqMan (qPCR) использовалась для титрования очищенного AAV. Обрабатывайте векторы AAV ДНКазой I и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут, затем инкубируйте при 95 °C в течение 10 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера реакции 10 мкл используется 2 мкл образца вируса AAV, 1 мкл ДНКазы, 1 мкл ДНКазного буфера и 6 мкл H2O. Может быть выполнен в амплификаторе с ПЦР-пробирками. Подготовьте наборы грунтовок, предназначенные для области вставки AAV.Примечание: Мишенями могут быть промотор, трансген и репортер в конструкции AAV. Капсюли перечислены в таблице 5. Подготовьте стандарты ДНК-плазмид (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 и 0,0001 пг/мкл) и отрицательный контроль (H2O). Приготовьте мастер-смесь для количественной ПЦР, включая праймеры, в соответствии с инструкциями производителя. Поместите стандарты и образцы в трех экземплярах на ПЦР-планшет. Добавьте смесь для количественной ПЦР в стандарты и образцы. Запечатайте планшет и выполните реакцию количественной ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Условия реакции зависят от материалов/реагентов и инструмента. Применимы быстрые и обычные циклы ПЦР. Вычислить титр вируса AAV.ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация образца в этом протоколе составляет 1/10 разбавления от исходных образцов. Аликотируйте вирус AAV в пробирках объемом 1,5 мл и храните при температуре 4 °C до одного месяца и храните при температуре -80 °C в течение длительного времени.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте циклов замораживания/размораживания при хранении. При использовании для экспериментов in vivo не используйте размораживание более двух аликвот. 10. Контроль качества AAV ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусы AAV характеризовали по чистоте путем окрашивания серебром SDS-PAGE с использованием геля SDS-PAGE и окрашивали с помощью коммерчески доступного набора для окрашивания. Денатурация 3 x 109 vg образца вируса AAV с буфером Laemmli.ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте эталонный вирус AAV в качестве контроля. Используется референсный полный капсид AAV6-CMV-GFP. Загрузите денатурированный AAV на гель SDS-PAGE с градиентом 4%-20% и работайте при напряжении 180 В в течение 50 минут. Снимите гель с пластины для электрофореза. Окрашивайте гель набором для окрашивания серебром в соответствии с инструкцией производителя. Проверьте капсидные белки AAV VP1, VP2 и VP3.ПРИМЕЧАНИЕ: Чистый вирус AAV содержит только капсидный белок VP1, VP2 и VP3. Если они не чистые, на геле будут видны другие белковые полосы.ПРИМЕЧАНИЕ: Проводилась просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) рекомбинантных вирионов AAV, окрашенных негативным окрашиванием, для оценки морфологической целостности и соотношения полных/пустых. Возьмите ЭМ-сетку с помощью пинцета и сядьте на скамейку блестящей стороной сетки вверх. Нанесите 5 мкл образца AAV на сетку и дайте ему высохнуть путем выпаривания.ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости разбавьте AAV. 1012 вг/мл – это средний титр. На высыхание сетки может уйти 30-60 минут. Промойте сетку пипетированием, капля за каплей, добавив на решетку около 200 μл H2O. Удалите лишнюю воду, медленно положив хроматографическую бумагу вертикально рядом с сеткой. Нанесите 5 мкл 2% раствора уранилацетата на решетку. Высиживайте в течение 5 минут и снимите фитиль, как упоминалось выше. Дайте сетке высохнуть. Визуализируйте частицы AAV под просвечивающим электронным микроскопом (с 50 000-кратным увеличением). Вирусные капсиды с вирусным геномом будут выглядеть как однородные белые шестиугольники, в то время как пустые капсиды будут выглядеть как шестиугольники с белым ободком, но темным центром. Наугад посчитайте не менее 100 частиц, чтобы определить примерный процент полных и полных. пустые частицы AAV.