유전자 치료 분야가 계속 발전함에 따라 이러한 문제를 해결할 수 있는 혁신적인 방법에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 여기에서는 cell factory 플랫폼을 사용하여 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하여 in vivo 연구의 품질 표준을 충족하는 고유한 방법을 제시합니다.
전임상 유전자 치료 연구, 특히 설치류 및 대형 동물 모델에서는 수율과 순도가 높은 AAV 벡터의 생산이 필요합니다. 연구 실험실의 전통적인 접근 방식은 종종 HEK293T 세포를 배양하기 위해 세포 배양 접시를 광범위하게 사용하는 것을 포함하는데, 이는 힘들고 문제가 될 수 있는 과정입니다. 여기에서는 특정 셀 팩토리(또는 셀 스택, CF10) 플랫폼으로 이 프로세스를 단순화하는 고유한 사내 방법을 제시합니다. 폴리에틸렌 글리콜/수용성 2상 분할과 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리의 통합은 생성된 AAV 벡터의 수율과 순도를 모두 향상시킵니다. AAV 벡터의 순도는 SDS-PAGE 및 은 염색을 통해 검증되며, 전체 입자와 빈 입자의 비율은 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 결정됩니다. 이 접근법은 in vivo 연구에 대한 품질 요구를 충족하기 위해 개선된 정제 방법과 함께 높은 수율로 AAV 벡터를 생산할 수 있는 효율적인 cell factory 플랫폼을 제공합니다.
아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터는 유전자 치료 연구에서 없어서는 안 될 도구가 되었으며, 유전자 전달을 위한 효능과 안전성의 고유한 조합을 제공합니다1. 실험실 환경에서 AAV를 생성하는 전통적인 방법은 유전자 치료에 대한 이해와 응용을 발전시키는 데 중추적인 역할을 해왔다2. 그러나 이러한 방법은 기초적이기는 하지만 특히 수율, 시간 효율성 및 생성된 벡터의 품질, 특히 전체 입자와 빈 입자의 비율 측면에서 특정 한계와 과제를 나타냅니다3.
AAV 생산을 위한 기존 절차는 주로 HEK293 세포의 transfection을 포함합니다4. 일반적으로 세포 배양 접시에서 수행되는 이 과정에서는 관심 유전자가 포함된 플라스미드와 도우미 플라스미드 및 AAV 캡시드 플라스미드 5,6으로 세포를 transfection해야 합니다. 형질주입 후, 세포는 AAV 입자를 생성하고, 그런 다음 이를 수확하고 정제합니다 5,6. 정제 과정에는 종종 초원심분리가 포함되는데, 이는 고순도 AAV 벡터를 얻기 위한 중요한 단계이다7. 특히 염화세슘(CsCl) 또는 요오딕산올 구배를 사용하는 초원심분리는 세포 파편 및 기타 불순물에서 AAV 입자를 분리하는 표준 방법입니다8. 이 단계는 AAV 벡터의 원하는 순도와 농도를 달성하는 데 매우 중요하며, 이는 유전자 전달에서의 효능에 직접적인 영향을 미친다8. 널리 사용됨에도 불구하고 기존의 초원심분리에는 단점이 있습니다. 예를 들어, 이 방법에서 AAV 벡터의 수율은 가변적일 수 있고 종종 낮을 수 있으며, 이는 특히 in vivo 연구 또는 대형 동물 모델에서 대량의 high-titer 벡터가 필요한 경우 상당한 문제를 제기합니다9.
AAV 벡터 품질의 또 다른 중요한 측면은 전체 입자와 빈 입자10의 비율입니다. AAV 제제에는 종종 이러한 입자의 혼합물이 포함되어 있습니다. 그러나 전체 입자에만 치료용 유전 물질이 포함되어 있습니다. 빈 입자의 비율이 높으면 유전자 전달의 효율성이 크게 감소할 수 있다10. 따라서 full particles 대 empty particle의 비율을 평가하고 최적화하는 것은 AAV 벡터의 효능을 평가하는 데 있어 중요한 파라미터입니다. 전통적인 방법은 AAV 벡터를 생성할 수 있지만, 종종 이 비율을 일관되게 제어하는 데 어려움을 겪어 벡터 효능(vector potency)10의 변동을 초래한다.
여기에서는 노동 집약적인 HEK293T 세포 배양을 세포 접시에서 사용하지 않는 세포 공장 플랫폼을 사용하여 폴리에틸렌 글리콜/수성 2상 분할을 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리와 통합하는 고수율 및 고순도 AAV 벡터를 생성하는 프로세스를 간소화하는 고유한 방법을 제시합니다. AAV 벡터 순도는 SDS-PAGE 및 은 염색을 통해 확인되며, 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 전체 대 비어 있는 입자 비율을 측정하여 in vivo 연구11의 품질 표준을 충족합니다.
여기에서는 cell factory 플랫폼(CF10)을 사용하여 high-titer 및 고품질 AAV 벡터의 대량 생산을 위한 기술적으로 발전된 프로토콜이 소개되어 기존 cell culture dish 방법에 비해 크게 개선되었습니다. 세포 공장의 사용은 많은 양의 세포를 배양하는 과정을 단순화하여 AAV 바이러스의 생산을 보다 효율적으로 촉진합니다1. 또한, 특히 10mM HEPES 및 2% FBS가 보충된 저포도당 DMEM을 사용하여 배양 조건을 최적화함으로써 바이러스 생산이 크게 향상되었음을 확인했으며, 이는 바이러스 수율에서 세포 환경의 중요한 역할을 나타냅니다.
세포 펠릿과 배양 배지의 AAV를 결합한 개정된 정제 프로토콜은 많은 기존 프로토콜에서 볼 수 있는 낮은 바이러스 수율과 불순물이라는 일반적인 문제를 해결합니다. 클로로포름 추출 및 수성 2상 분할 단계는 대부분의 단백질 오염 물질을 효과적으로 제거하며, AAV는 황산암모늄 단계에서 용해된 상태로 유지됩니다. 기존의 그래디언트 초원심분리 방법과 달리 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리와 결합된 PEG/수성 2상 분할을 사용하여 AAV 벡터의 수율과 순도를 모두 개선한 것은 PEG/수용성 2상 분할을 통한 향상된 초기 분리, 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리를 통한 정제된 순도 및 오염 물질 동시 정제의 감소에 기인할 수 있습니다12. 첫째, 초원심분리 전에 PEG/수성 2상 분할을 도입하면 세포 파편 및 기타 오염 물질에서 AAV 입자의 초기 분리가 크게 개선됩니다. 고분자량 중합체인 PEG는 수용액과 혼합될 때 두 개의 별개의 상을 생성한다13. AAV 벡터는 이러한 상 중 하나(일반적으로 PEG가 풍부한 상)로 우선적으로 분할되는 경향이 있는 반면, 많은 오염 물질과 불순물은 다른13개의 상으로 분할됩니다. 이러한 선택적 분할은 AAV 입자를 효과적으로 농축하고 초원심분리 전에도 불순물의 상당 부분을 제거하여 수율을 높이고 초원심분리 단계13으로 유입되는 오염 물질 부하를 줄입니다. 둘째, 요오딕사놀 그래디언트 초원심분리는 AAV 벡터의 순도를 더욱 정교하게 만듭니다. 비이온성 이소삼투압 그래디언트 매질인 요오딕사놀은 기존 CsCl 그래디언트에 비해 더 부드럽고 제어된 분리를 가능하게 합니다14. 이 그래디언트에서, AAV 입자는 그들의 부력 밀도(14)에 해당하는 그래디언트의 위치로 이동한다. 중요한 것은 이 과정이 벡터 품질의 중요한 결정 요인인 빈 캡시드(유전 물질 결핍)에서 전체 AAV 캡시드(유전자 페이로드 포함)를 분리하는 데 효과적이라는 것입니다. 요오딕사놀의 이소삼투압 특성은 또한 CsCl과 같은 고삼투압제보다 AAV 캡시드의 무결성을 더 잘 보존하여 잠재적으로 온전한 기능성 벡터의 수율을 높일 수 있다14. 마지막으로, 기존의 초원심분리 방법, 특히 CsCl 그래디언트를 사용하는 방법은 때때로 AAV 벡터와 유사한 부력 밀도를 가진 오염 물질을 공동 정제할 수 있습니다15. PEG 분할을 예비 단계로서 사용함으로써, 이러한 오염 물질의 부하가 초원심분리(13) 전에 크게 감소된다. 이러한 오염 물질 부하의 감소는 요오딕사놀 그래디언트가 AAV 벡터를 정제하는 데 보다 효과적이고 선택적으로 작용하여 더 높은 순도로 이어질 수 있음을 의미합니다15.
AAV 벡터의 순도와 품질은 은 염색 및 TEM11을 통해 엄격하게 평가됩니다. 순도가 90%를 초과하는 AAV 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3에 해당하는 3개의 주요 띠를 관찰한 것은 이러한 AAV 벡터가 in vivo 사용에 적합함을 나타냅니다. full-to-empty capsid 비율을 결정하기 위한 TEM 분석은 특히 중요한데, 빈 capsid의 비율이 높으면 유전자 전달 효율이 감소하고 잠재적인 면역 반응이 발생할 수 있기 때문입니다11. 이 품질 검사는 필수적이지만 절차상의 복잡성을 가중시키고 추가적인 기술 전문 지식이 필요할 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 AAV 벡터 생산, 특히 확장성 및 순도 측면에서 상당한 기술적 발전을 제공합니다. 그러나 정제 공정과 관련된 복잡성과 특수 장비 및 전문 지식에 대한 필요성은 특정 연구 환경에서 적용하는 데 여전히 사소한 제한 사항이 될 수 있습니다. 이러한 기술을 더욱 정교화하고 단순화하면 이 접근 방식을 유전자 치료 연구 분야에서 더 쉽게 접근할 수 있고 널리 적용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
TZ가 실험을 설계했습니다. TZ, VD, SB 및 JP가 실험을 수행했습니다. TZ와 VD는 데이터를 생성하고 분석하였다. TZ와 YX가 원고를 썼다. TZ와 GG는 원고를 수정했다. 이 연구는 피츠버그 UPMC 아동병원의 지원을 받았습니다.
293T/17 cells | ATTC | CRL-11268 | |
(NH4)2SO4 | Millipore Sigma | 1.01217.1000 | |
0.5 M EDTA | MilliporeSigma | 324506-100ml | |
1 mL Henke-Ject syringe | Fisher Scientific | 14-817-211 | |
10% pluronic F68 solution | Fisher Scientific | 24-040-032 | |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Biorad | 1610732 | |
1M HEPES | Fisher Scientific | 15-630-080 | |
2% Uranyl Acetate Solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
4%–20% Precast Protein Gels | biorad | 4561094 | |
40% PEG solution | Sigma | P1458-50ML | |
AAV6 reference full capsids | Charles River Laboratories | RS-AAV6-FL | |
Accutase Cell Detachment Solution | Fisher Scientific | A6964-100ML | |
Benzonase | Sigma | E1014-25KU | |
BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm | Fisher Scientific | 12-556-003 | |
Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC905024 | |
Corning PES Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-754-29 | |
Dialysis Cassettes, 10 K MWCO | Fisher Scientific | PI66810 | |
Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 µm | Fisher Scientific | FB12566506 | |
Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 µm | Fisher Scientific | FB12566507 | |
Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 µm | Fisher Scientific | FB12566504 | |
DMEM high glucose | Fisher Scientific | 10-569-044 | |
DMEM low glucose | Fisher Scientific | 10567022 | |
DNase | NEB | M0303S | |
DPBS 1x | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
Fetal Bovin Serum (FBS) | Biowest | S1620 | |
Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu-50 | |
glycerol | Sigma | G5516-1L | |
KCl | Sigma | P9541-500G | |
LB agar | Sigma | L2897-250G | |
LB broth | Fisher Scientific | BP9732-500 | |
MgCL2·6H2O | Sigma | M9272-100G | |
NEB stable competent cells | NEB | C3040H | |
Nest Biofactory 10 chamber | MidSci | 771302 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 740424 | |
Opti-MEM | Fisher Scientific | 31-985-088 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Millipore Sigma | D1556-250ml | |
pAAV-CMV-GFP | Addgene | 105530 | |
pAAV-DJ | Cell BioLab | VPK-420-DJ | |
pAAV-RC6 | Cell BioLab | VPK-426 | |
pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
PEG 8000 | Promega | V3011 | |
PEI Max | Polysciences, Inc | 49553-93-7 | |
Pen-Strep | Fisher Scientific | 15-140-163 | |
Phenol red | Millipore Sigma | 1.07242.0100 | |
Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | |
QuickSeal tube | Fisher Scientific | NC9144589 | |
Sodium Chloride | Sigma | 1162245000 | |
sodium deoxycholate | Millipore Sigma | D6750-100G | |
Taqman Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32209 |