基于生物杂化蚊虫叮咬的原子力显微镜探针的研制
Summary
对昆虫叮咬行为进行定量和受控调查对于制定有效的策略来对抗病媒传播疾病至关重要。在此背景下，介绍了一种制备生物杂化原子力显微镜（AFM）探针的方法。
Abstract
蚊子因其传播疾病的能力而臭名昭著，是对人类最致命的动物，对公共卫生构成持续挑战。目前使用的一级预防策略涉及化学驱虫剂，由于蚊子迅速产生抗药性，化学驱虫剂往往被证明是无效的。因此，发明新的预防方法至关重要。这种发展取决于对蚊子叮咬行为的透彻理解，因此需要一种实验装置，该实验装置能够通过可控的测试参数和定量测量准确复制实际叮咬场景。为了弥合这一差距，设计了一种生物混合原子力显微镜（AFM）探针，其尖端是生物毒刺 – 特别是蚊子盂唇。这种生物混合探针与标准AFM系统兼容，可以对蚊子的渗透行为进行近乎真实的模拟。这种方法标志着在叮咬机制的定量研究方面向前迈出了一步，有可能为对抗病媒传播疾病（VBDs）建立有效的屏障，并为对抗蚊媒传播疾病开辟新的途径。
Introduction
世界卫生组织 （WHO） 报告说，病媒传播疾病 （VBD） 占所有传染病的 17% 以上，每年导致全球超过 7,00,000 人死亡。例如，作为世界上最致命的动物，蚊子通过吸血节肢动物传播登革热、疟疾和寨卡病毒等多种病原体，每年导致 7 亿例感染1。探索制定有效措施预防VBDs至关重要，包括模仿蚊子的侵入行为以研究其叮咬机制，以及研究潜在障碍以证明其预防侵入的有效性。一个关键的挑战是制定适当的方法来进行这种调查。在文献中已经做出了努力，包括开发类似于蚊子毒刺几何形状的微尺度针头;然而，许多用于制造这些微针的材料（即粘弹性材料2、硅 （Si）、玻璃、陶瓷3 等）与蚊子长鼻的生物材料具有不同的机械性能。工程材料可能很脆，容易断裂和屈曲 3,4，而蚊子的长鼻可以更好地承受断裂或屈曲4.使用蚊子的盂唇而不是工程材料的生物混合探针的好处是，它可以更准确地表示蚊子的穿刺机制。此外，必须将专用工具与微针集成以执行定量研究，例如力5 的准确测量，这对于使用工程微针的定制设置来说不容易实现。
基于原子力显微镜 （AFM） 的方法很有前途的，因为它通过使用带有超细尖端的悬臂来操作，该悬臂被小心地放置在靠近样品表面的位置。尖端既可以扫描表面，也可以被压向/压入表面，由于其与样品的相互作用，会受到不同的吸引力或排斥力6.这些相互作用导致悬臂的偏转，通过激光束从悬臂顶部反射到光电探测器6 上来跟踪偏转。AFM 对系统运动的超强灵敏度使 AFM 能够进行各种测量，包括但不限于皮米精度的形态映射、从皮牛顿到微牛顿的力测量以及全面的多物理场研究7。例如，可以执行 AFM 压痕以精确评估对样品施加力的响应，并通过与适当的分析模型耦合来测量样品的硬度、弹性和其他机械性能8。AFM 的探针通常由硅 （Si） 或氮化硅 （Si3N4）8 制成，长度为 20-300 μm9 ，尖端半径约为几到几十纳米10。纳米级针尖半径是高分辨率成像等应用的理想选择;然而，对于试图在刚度、半径、形状和纵横比方面模仿穿透行为的研究，它不具备生物毒刺的特征。例如，蚊子的微针结构是束，其纵横比为 ~6011 （长度 ~1.5 毫米至 2 毫米;直径 ~30 μm）12。虽然可以假设传统的AFM探针类似于盂唇等生物毒刺，但其独特的材料特性和尺寸并不能反映咬合过程中的真实情况。
为了能够对模仿昆虫或其他动物用毒刺的生物叮咬的穿透行为进行定量研究，这里开发了一种制造生物混合AFM悬臂的工艺，该工艺以生物毒刺为尖端。作为一个案例研究，成功地展示了一种带有蚊子盂唇尖端的AFM悬臂。利用文献中关于蚊子用来刺穿受害者皮肤的典型插入力的现有信息12,13，这种生物混合AFM悬臂有可能在常规AFM下实现蚊子叮咬的近乎真实的模拟。利用微生物毒刺制造生物混合 AFM 悬臂的方案也可应用于开发其他基于 Sharp Stinger 的生物混合 AFM 悬臂，用于对各种咬合机制进行定量研究。
术语
长鼻及其相关组件的示意图如图 1 所示，其定义是 （1） 长鼻：蚊子口中的身体部位，允许蚊子自我进食，其核壳结构由束（核心）和唇（壳）组成，（2） 唇：长鼻的深色和钝的外壳2，（3）束：一组细长的针头包含在唇内，包括两个上颌骨、两个下颌骨、一个下咽部和一个盂唇2、（4）下咽部：负责将唾液分泌到宿主的血液中2、（5）上颌骨：协助摄食机制的锯齿状构件2、（5）下颌骨：类似于上颌骨，它们帮助蚊子摄食机构，并有一个锋利的尖端2，（6）盂唇：穿透受害人皮肤的主要构件，比上颌骨、下颌骨和下咽部大得多。它还具有感觉结构，使其能够在皮肤下找到血管和内部通道2，（7） 操纵器：具有三个自由度和微米级定位精度的组件，允许在 XYZ 方向上移动，（8） 夹具组件：安装在机械手上的定制 2 部分夹具，用于在实验过程中夹紧无尖端 AFM 悬臂。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议的第 1 步旨在清洁不需要的阴唇的生物样本。为了实现这一点，在阴唇上做一个切口，但不在位于阴唇正下方的束上做一个切口（图1）。由于束和唇在其界面处没有连接在一起（即，唇可以沿着束自由滑动，并且仅通过其附着在蚊子头上保持到位），因此进行的切口旨在将唇的一部分与蚊子的头部分开，从而促进外罩的移除。当唇形物从样品中拉出时，技术人员应该…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢加拿大新前沿研究基金 （NFRF）、加拿大自然科学与工程研究委员会 （NSERC） 发现计划以及魁北克自然与技术研究基金会 （FRQNT） 硕士培训奖学金的资金支持。作者还要感谢McGill的Yaoyao Zhao教授团队对某些组件的3D打印提供的技术支持。
Materials
| 5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers | Excelta | N/A | For manipulating/dissecting the proboscis. |
| C-4D Probe station | Everbeing Int’l Corp | N/A | Used for AFM assembly. |
| Tipless Tapping Mode Cantilever | NanoAndMore USA | TL-NCH | AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 – 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 – 497 kHz) Length: 125 µm (115 – 135 µm) Larghezza: 30 µm (22.5 – 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 – 5 µm) |
| UV Expoxy | Let's resin | ALR00146 | For stinger attachment. |
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