新生小鼠骨髓分离和骨髓来源巨噬细胞的制备
Summary
该方案描述了一种非酶和直接的方法，用于分离 7-9 日龄的新生小鼠骨髓细胞，并使用 L929 细胞的上清液作为粒细胞集落刺激因子 （M-CSF） 的来源来产生分化的巨噬细胞。进一步分析骨髓来源的巨噬细胞表面抗原 F4/80 、 CD206 、 CD11b 和功能能力。
Abstract
从成年小鼠中分离骨髓的各种技术已经得到广泛确立。然而，从新生小鼠中分离骨髓具有挑战性且耗时，但对于某些模型来说，它在翻译上是相关和必要的。该方案描述了一种从 7-9 日龄幼崽制备骨髓细胞的有效且直接的方法。然后，这些细胞可以进一步分离或分化为感兴趣的特定细胞类型。巨噬细胞是重要的免疫细胞，在炎症和感染中起主要作用。在发育过程中，新生儿巨噬细胞对组织重塑有显著贡献。此外，新生儿巨噬细胞的表型和功能与成年巨噬细胞不同。该方案还概述了在 L929 条件培养基存在下新生儿巨噬细胞与分离骨髓细胞的分化。使用流式细胞术分析评估分化新生儿巨噬细胞的表面标志物。为了证明功能，还使用 pH 敏感染料偶联的大 肠杆菌测试了吞噬效率。
Introduction
骨髓包含造血干细胞群和间充质干细胞群，这些细胞群是自我更新的，可以分化成各种细胞谱系。骨髓中的造血干细胞产生骨髓和淋巴谱系1。间充质干细胞产生成骨细胞（骨骼）、脂肪细胞（脂肪）或软骨细胞（软骨）2。这些细胞在细胞生物学和组织工程领域有多种应用，包括基因治疗 3,4。存在于骨髓中的祖细胞在谱系特异性生长因子存在的情况下分化成特定的细胞类型。促红细胞生成素促进红细胞祖细胞的增殖，粒细胞集落刺激因子 （G-CSF） 刺激中性粒细胞集落的生长，血小板生成素调节血小板的产生，这是谱系特异性生长因子的几个例子5。细胞表面抗原标记的 FACS 和磁激活细胞分选 （MACS） 是分离和纯化特定骨髓来源细胞类型的成熟方法6。
尽管新生儿研究正在朝着寻找新生儿死亡原因和解决早产并发症的方向发展，但直接治疗开发仍然是一个未得到满足的医疗需求。Smith 和 Davis 表示，“儿科患者仍然是治疗性孤儿”7。在新生儿临床研究中，获得同意存在一些挑战，例如样本小、结果的终生影响以及获得同意的伦理问题8.因此，对特定于新生儿的 体内 和 体外 研究模型以实现转化相关性的需求很高。由于解剖水平和组织水平之间的相似性、较短的妊娠期和窝产仔数，啮齿动物是研究最多的哺乳动物模型系统。
在这里，我们描述了一种详细的、高度可行的和可重复的程序，用于从 7-9 日龄的小鼠幼崽中分离骨髓及其分化为巨噬细胞的能力。然而，通过使用不同的分化信号，可以实现多种细胞谱系。我们还证明了细胞表面标志物的存在以及骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 预期的 体外 吞噬活性的存在。
Protocol
Representative Results
Discussion
涉及新生小鼠模型的研究可能会带来许多挑战。与成人相比，新生儿的免疫系统发育中是独一无二的8。因此，不应假设从成年动物模型生成的数据适用于新生儿，几篇已发表的著作已经很好地阐明了这一想法18,19。因此，新生儿特异性模型和细胞来源对于研究早期免疫反应的复杂性是必要的。然而，由于新生小鼠的大小、敏感性和脆?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国立卫生研究院 [R01 AI163333] 对 CMR 的支持。我们感谢以下赠款为西弗吉尼亚大学流式细胞术和单细胞核心设施提供的额外资金支持：WV CTSI 赠款 GM104942、肿瘤微环境 CoBRE 赠款 GM121322 和 NIH 赠款 OD016165。
Materials
| 40 µm strainer | Greiner | 542040 | Cell culture |
| 96 well round (U) bottom plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | Cell culture |
| Anti-mouse CD11b-BV786 | BD Biosciences | 740861 | FACS analysis |
| Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488 | BD Biosciences | 141709 | FACS analysis |
| Anti-mouse F4/80-PE | BD Biosciences | 565410 | FACS analysis |
| Countess3 | Thermo Scientific | TSI-C3ACC | Automated cell counter |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Cell culture |
| DMSO | VWR | WN182 | Cell culture |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | Cell culture |
| Escherichia coli O1:K1:H7 | ATCC | 11775 | Infection |
| EVOS FL | Invitrogen | 12-563-649 | Cell Imaging System |
| FBS | Avantor | 76419-584 | Cell culture |
| FluoroBright BMDM | Thermo fisher Scientific | A1896701 | Dye free culture media |
| Glutamine | Cytiva | SH30034.01 | Cell culture |
| HEPES | Cytiva | SH30237.01 | Cell culture |
| L-929 | ATCC | Differentiation | |
| LSRFortessa | Becton Dickinson | Flowcytometer | |
| Lysotracker red DND 99 | Invitrogen | L7528 | Fluorescent dye |
| MEM | Corning | 15-010-CV | Cell culture |
| Penicillin /streptomycin | Hyclone | SV30010 | Cell culture |
| pHrodo green STP ester | Invitrogen | P35369 | Fluorescent dye |
| T75 flask | Cell star | 658170 | Cell culture |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300120 | Cell culture |
| Zeiss 710 | Zeiss | P20GM103434 | Confocal |
Riferimenti
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