Modello immunocompetente Intestino-on-Chip per l'analisi delle risposte immunitarie della mucosa intestinale
Summary
Il nostro protocollo dettagliato delinea la creazione e l’uso del modello avanzato di intestino su chip, che simula la mucosa intestinale umana con strutture 3D e vari tipi di cellule, consentendo un’analisi approfondita delle risposte immunitarie e delle funzioni cellulari in risposta alla colonizzazione microbica.
Abstract
È stato sviluppato un modello avanzato di intestino su chip che ricrea strutture epiteliali 3D organotipiche simili a villi e cripte. Il modello immunocompetente comprende le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC), le cellule epiteliali intestinali Caco-2, i macrofagi residenti nei tessuti e le cellule dendritiche, che si auto-organizzano all’interno del tessuto, rispecchiando le caratteristiche della mucosa intestinale umana. Un aspetto unico di questa piattaforma è la sua capacità di integrare le cellule immunitarie primarie umane circolanti, migliorando la rilevanza fisiologica. Il modello è progettato per studiare la risposta del sistema immunitario intestinale alla colonizzazione e all’infezione batterica e fungina. Grazie alle dimensioni della cavità ingrandite, il modello offre diverse letture funzionali come saggi di permeazione, rilascio di citochine e infiltrazione di cellule immunitarie ed è compatibile con la misurazione in immunofluorescenza di strutture 3D formate dallo strato di cellule epiteliali. Fornisce informazioni complete sulla differenziazione e la funzione cellulare. La piattaforma intestino su chip ha dimostrato il suo potenziale nel chiarire le complesse interazioni tra surrogati di un microbiota vivente e tessuto ospite umano all’interno di una piattaforma di biochip microfisiologica perfusa.
Introduction
I sistemi Organ-on-Chip (OoC) rappresentano una tecnica emergente di coltura cellulare 3D in grado di colmare il divario tra la coltura cellulare 2D convenzionale e i modelli animali. Le piattaforme OoC sono tipicamente costituite da uno o più compartimenti contenenti cellule tessuto-specifiche cresciute su un’ampia gamma di scaffold come membrane o idrogel1. I modelli sono in grado di imitare una o più funzioni organotipiche definite. Le pompe consentono la perfusione microfluidica continua del terreno di coltura cellulare per la rimozione dei prodotti di scarto cellulare, forniscono nutrienti e fattori di crescita per una migliore differenziazione cellulare e ricreano le condizioni essenziali in vivo. Con l’integrazione delle cellule immunitarie, i sistemi OoC possono imitare la risposta immunitaria umana in vitro2. Ad oggi è stata presentata un’ampia gamma di organi e unità funzionali1. Questi sistemi includono modelli del sistema vascolare3, polmonare4, fegato 2,5 e intestino6 che possono essere facilitati per test farmacologici 5,7 e studi sulle infezioni 6,8.
Qui presentiamo un modello di intestino umano su chip che integra cellule epiteliali umane formando una topografia 3D organotipica di strutture simili a villi e cripte combinate con un rivestimento endoteliale e macrofagi residenti nei tessuti. Il modello viene coltivato in un biochip microfluidicamente perfuso sotto forma di vetrino microscopico. Ogni biochip è costituito da due cavità microfluidiche separate. Ogni cavità è divisa da una membrana porosa in polietilene tereftalato (PET) in una camera superiore e una inferiore. La membrana stessa funge anche da impalcatura per la crescita delle cellule su ciascun lato. I pori della membrana consentono il crosstalk cellulare e la migrazione cellulare tra gli strati cellulari. Ogni camera è accessibile da due porte femmina delle dimensioni di un luer lock. Opzionalmente, un’ulteriore porta delle dimensioni di un mini-luer lock può fornire l’accesso alla camera superiore o inferiore (Figura 1).
La piattaforma OoC offre una serie di letture che possono essere ottenute da un singolo esperimento. L’intestino-on-chip è progettato per combinare la coltura cellulare 3D perfusa, l’analisi degli effluenti e la microscopia a fluorescenza per valutare l’espressione dei marcatori cellulari, i tassi di metabolizzazione, la risposta immunitaria, la colonizzazione e l’infezione microbica e la funzione barriera 3,6,8. Il modello include cellule immunitarie residenti nei tessuti e il contatto diretto di microrganismi viventi con il tessuto ospite, che rappresenta un vantaggio rispetto ad altri modelli pubblicati9. Inoltre, le cellule epiteliali si auto-organizzano in strutture tridimensionali che forniscono un’interfaccia fisiologicamente rilevante per la colonizzazione con un microbiota vivente6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato descrive in dettaglio i passaggi necessari per generare un modello di intestino su chip immunocompetente. Sono state descritte tecniche specifiche e possibili metodi di lettura come la microscopia a immunofluorescenza, l’analisi di citochine e metaboliti, la citometria a flusso, l’analisi di proteine e genetiche e la misurazione della permeabilità.
Il modello descritto è costituito da HUVEC primari, macrofagi derivati da monociti e cellule dendritiche derivate da mon…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Centro di ricerca collaborativa PolyTarget 1278 (numero di progetto 316213987) a V.D.W. e A.S.M. A.F. e A.S.M. riconoscono inoltre il sostegno finanziario del Cluster di Eccellenza “Balance of the Microverse” nell’ambito della Strategia di Eccellenza della Germania – EXC 2051 – Project-ID 690 390713860. Ringraziamo Astrid Tannert e il Jena Biophotonic and Imaging Laboratory (JBIL) per averci fornito l’accesso al loro microscopio a scansione laser confocale ZEISS LSM980. La Figura 1C e la Figura 2 sono state create con Biorender.com.
Materials
| 96-well plate black, clear bottom | Thermo Fisher | 10000631 | Consumables |
| Acetic acid | Roth | 3738.4 | Chemicals |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 715-545-150 | Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 711-605-152 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A31573 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Axiocam ERc5s camera | Zeiss | 426540-9901-000 | Technical equipment |
| Basal Medium MV, phenol red-free | Promocell | C-22225 | Cell culture consumables |
| Biochip | Dynamic 42 | BC002 | Microfluidic consumables |
| BSA fraction V | Gibco | 15260-037 | Cell culture consumables |
| C2BBe1 (clone of Caco-2) | ATCC | CRL-2102 | Epithelial Cell Source |
| Chloroform | Sigma | C2432 | Chemicals |
| CO2 Incubator | Heracell | 150i | Technical equipment |
| Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | Cell culture consumables |
| Coverslips (24 x 40 mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | Consumables |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 705-165-147 | Secondary Antibody Vascular Staining |
| Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L) | Jackson Immuno Research | 712-165-150 | Secondary Antibody Epithelial Staining |
| DAPI (4',6-Diamidin-2-phenylindol, Dilactate) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | D3571 | Vascular and Epithelial Staining |
| Descosept PUR | Dr.Schuhmacher | 00-323-100 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose | Gibco | 41965-062 | Cell culture consumables |
| DMEM high glucose w/o phenol red | Gibco | 31053028 | Cell culture consumables |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-169 | Cell culture consumables |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | Cell culture consumables |
| EDTA solution | Invitrogen | 15575-038 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | Cell culture consumables |
| Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | Cell culture consumables |
| Ethanol 96%, undenatured | Nordbrand-Nordhausen | 410 | Chemicals |
| Fetal bovine Serum | invitrogen | 10270106 | Cell culture consumables |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | Chemicals |
| Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | Chemicals |
| Gentamycin (10mg/mL) | Sigma Aldrich | G1272 | Cell culture consumables |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Gibco | 35050061 | Cell culture consumables |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell culture consumables |
| Hoechst (bisBenzimid) H33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Epithelial Staining |
| Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma | Millipore | 616397 | Cell culture consumables |
| Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | Cell culture consumables |
| Human recombinant M-CSF | Peprotech | 300-25 | Cell culture consumables |
| Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | Fluorescence Microscope Setup |
| Laser Scanning Microscope | Zeiss | CLSM980 | Fluorescence Microscope Setup |
| Lidocain hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | Cell culture consumables |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630 | Cell culture consumables |
| Loftex Wipes | Loftex | 1250115 | Consumables |
| Low attachment tubes (PS, 5 mL) | Falcon | 352052 | Consumables |
| Luer adapter for the top cap (M) | Mo Bi Tec | M3003 | Microfluidic consumables |
| Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | Microfluidic consumables |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140 | Cell culture consumables |
| Methanol | Roth | 8388.2 | Chemicals |
| Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | Fluorescence Microscope Setup |
| Microscope slides | Menzel | MZ-0002 | Consumables |
| Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 14-0688-82 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1) | Sigma-Aldrich, Millipore | MABT26 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Multiskan Go plate reader | Thermo Fisher | 51119300 | Technical equipment |
| Normal donkey serum | Biozol | LIN-END9010-10 | Chemicals |
| Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | Fluorescence Microscope Setup |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Cell culture consumables |
| Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | Microfluidic consumables |
| Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody | R&D Systems | AF938 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody | Dako | A0082 | Primary Antibody Vascular Staining |
| Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 61-7300 | Primary Antibody Epithelial Staining |
| Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | Fluorescence Microscope Setup |
| Primovert microscope | Zeiss | 415510-1101-000 | Technical equipment |
| Reglo ICC peristaltic pump | Ismatec | ISM4412 | Technical equipment |
| SAHA (Vorinostat) | Sigma Aldrich | SML0061-25MG | Chemicals |
| Saponin | Fluka | 47036 | Chemicals |
| S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 01.1602 | Consumables |
| S-Monovette, 9.0 mL K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | Consumables |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-088 | Cell culture consumables |
| Tank 4.5 mL | ChipShop | 10000079 | Microfluidic consumables |
| Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | Cell culture consumables |
| Trypsin | Gibco | 11538876 | Cell culture consumables |
| Tubing | Dynamic 42 | ST001 | Microfluidic consumables |
| Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | Consumables |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | W32464 | Epithelial Staining |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium |
| Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | Consumables |
| Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile | Greiner Bio-One | 657 160 | Consumables |
| Zen Blue Software | Zeiss | Version 3.7 | Microscopy Software |
Riferimenti
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