Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión
Summary
Este protocolo proporciona un procedimiento de preparación optimizado y elaborado para muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión. Es adecuado para aplicaciones que involucran el análisis de sinapsis en organoides retinianos maduros.
Abstract
Los organoides de la retina (RO) son un sistema de cultivo tridimensional que imita las características de la retina humana y que se han diferenciado de las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) en condiciones específicas. El desarrollo y la maduración de las sinapsis en las RO se han estudiado inmunocitoquímica y funcionalmente. Sin embargo, la evidencia directa de la ultraestructura de contacto sináptico es limitada, ya que contiene tanto sinapsis de cinta especiales como sinapsis químicas convencionales. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se caracteriza por una alta resolución y una historia respetable que dilucida el desarrollo de la retina y la maduración de las sinapsis en humanos y diversas especies. Es una herramienta poderosa para explorar la estructura sináptica en las RO y es ampliamente utilizada en el campo de investigación de las RO. Por lo tanto, para explorar mejor la estructura de los contactos sinápticos de RO a nanoescala y obtener evidencia microscópica de alta calidad, desarrollamos un método simple y repetible de preparación de muestras de RO TEM. Este documento describe el protocolo, los reactivos utilizados y los pasos detallados, incluida la preparación de la fijación de ósmosis inversa, la posfijación, la inclusión y la visualización.
Introduction
La retina, un órgano sensorial visual vital en humanos y mamíferos, exhibe una estructura laminada distinta caracterizada por tres capas nucleares que albergan somas neuronales y dos capas plexiformes formadas por conexiones sinápticas1, incluidas las sinapsis convencionales y la sinapsis de cinta especializada 2,3. La sinapsis en cinta desempeña un papel crucial en la transmisión de los impulsos vesicular de forma gradual 2,3. El proceso de visión implica la transmisión de señales electroópticas a través de varios niveles de neuronas y sinapsis, llegando finalmente a la corteza visual 4,5.
Los organoides de la retina (ROs) representan un sistema de cultivo tridimensional (3D) derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que imitan los estados fisiológicos del tejido retiniano in vitro 1,6,7. Este enfoque es prometedor para el estudio de las enfermedades de la retina8, el cribado de fármacos9 y sirve como una terapia potencial para las enfermedades degenerativas irreversibles de la retina, como la retinosis pigmentaria10 y el glaucoma11. Como potente sistema de conducción óptica in vitro, la sinapsis dentro de las RO es una estructura crucial que facilita la transformación y transferencia efectivas de la señal5.
A grandes rasgos, el desarrollo de la RO puede dividirse en tres etapas según sus rasgos morfológicos y perfiles de expresión molecular 6,12. Las RO en la etapa 1 (alrededor de D21-D60) comprenden células progenitoras neurales de la retina, muchas células ganglionares de la retina (RGC) y algunas células amacrinas (SAC), correspondientes a la primera época del desarrollo fetal humano. En la etapa 2 (alrededor de D50-D150), las RO expresan algunos precursores de fotorreceptores, interneuronas y genes relacionados con la sinaptogénesis, lo que representa una fase de transición. Los fotorreceptores desarrollan la madurez en la etapa 3 de ROs (alrededor de después de D100-D150), correspondiente a la tercera etapa del desarrollo fetal humano 6,12,13. En particular, en comparación con las RO en la etapa 1 y la etapa 2, las RO en la etapa 3 tienen una estructura laminar distinta cuyas sinapsis han madurado12, incluida la presencia de sinapsis en cinta14. Además, un estudio reciente ha confirmado que las sinapsis maduras existen para la transmisión de señales luminosas, lo que indica que son funcionales13. Por lo tanto, las RO en la etapa 3 a menudo se seleccionan para investigar la estructura sináptica.
La inmunohistoquímica se aplica ampliamente al estudio de la expresión de diversas proteínas moleculares. Sin embargo, la limitación de la microscopía óptica radica en su capacidad para observar solo un número restringido de células y moléculas específicas a la vez, lo que resulta en una falta de análisis exhaustivo de las relaciones entre las células y su entorno circundante. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se caracteriza por una alta resolución, con una resolución limitada de 0,1-0,2 nm, superando al microscopio óptico en ~10-20 veces15. Compensa los defectos de la microscopía óptica y se utiliza para dilucidar el desarrollo de la retina y la maduración de las sinapsis en humanos16,17 y diversas especies 18,19,20,21. La TEM permite la distinción directa de los componentes presinápticos y postsinápticos18,20, e incluso permite la observación exhaustiva de estructuras subcelulares como las cintas 2,3, las vesículas22 y las mitocondrias23. Por lo tanto, TEM es una herramienta esencial para identificar tipos de sinapsis y explorar la ultraestructura de los contactos sinápticos en RO a nanoescala.
Es crucial tener en cuenta que la preparación de la muestra es de gran importancia para adquirir micrografías electrónicas de alta calidad. Aunque algunos estudios han realizado EM en ROs 12,13,24, los procedimientos detallados no están claros. Dado que la calidad de la imagen de microscopía electrónica depende en gran medida del efecto de la fijación de la ósmosis inversa y la permeabilidad del reactivo, es necesario tener en cuenta varios factores importantes durante la preparación. En consecuencia, para investigar mejor los contactos sinápticos en las RO, presentamos un método con buena reproducibilidad que muestra los puntos de operación de la fijación de la RO, la inclusión y la identificación de los sitios de observación.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para observar la ultraestructura sináptica convencional y de cinta en RO mediante TEM. Este protocolo se basa en los métodos de preparación de la retina descritos anteriormente con algunas modificaciones20. Para mejorar la tasa de éxito del tratamiento de muestras y la calidad de las micrografías TEM, tenga en cuenta los siguientes puntos clave. En primer lugar, es importante reconocer que las RO se desarr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue respaldado en parte por subvenciones del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2022YFA1105503), el Laboratorio Estatal Clave de Neurociencia (SKLN-202103) y la Fundación de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (Y21H120019), la Fundación de Ciencias Naturales de China (82070981).
Materials
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| B27 supplement | Gibco | A3582801 | |
| Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
| Copper grids | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | AZH400HH | |
| DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
| Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Bacterial protease |
| DMEM/F12 medium | Gibco | #11320033 | |
| Embedding mold | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ10592 | |
| Epon-812 resin | Electron Microscopy Science | #14900 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
| Lead citrate | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ02618 | |
| L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | L-glutamine substitute |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Microscope slide | CITOTEST | 80312-3161 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of PB/PBS |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of PB/PBS |
| Non-essential amino acids | Sigma | #M7145 | |
| Optical microscope | Lab Binocular Biological Microscope | Xsz-107bnii | |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Oven | Bluepard | BPG9040A | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | #15140-122 | |
| Semi/ultrathin microtome | Reichert-Jung | 396649 | |
| Taurine | Sigma | #T0625 | |
| Toluidine blue | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
| Transmission Electron Microscopes | HITACHI | H-7500 | |
| Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 444203 |
Riferimenti
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