使用 HEK293 悬浮细胞生产高产腺相关载体批次
Summary
本文介绍了一种悬浮液HEK293基于细胞的AAV生产方案，从而减少了使用商业供应商提供的用于研究目的的组件进行载体生产所需的时间和劳动力。
Abstract
腺相关病毒载体 （AAV） 是研究中枢神经系统 （CNS） 的绝佳工具。创新衣壳，如AAV。PHP.eB，证明通过小鼠静脉注射对中枢神经系统进行广泛转导。为了实现可比的转导，与直接注射CNS实质相比，需要高出100倍的滴度（至少1 x 1011 个基因组拷贝/小鼠）。在我们集团中，AAV生产，包括AAV。PHP.eB 依赖于贴壁HEK293T细胞和三联转染方法。使用贴壁细胞实现高产量的AAV需要劳动和材料密集型过程。这种限制促使开发了一种在锥形管中基于悬浮液的细胞培养方案。将贴壁细胞中产生的AAV与悬浮液生产方法进行比较。比较使用转染试剂聚乙烯亚胺或TransIt的悬浮培养物。通过碘克沙醇梯度超速离心纯化AAV载体，然后使用离心过滤器进行缓冲液置换和浓缩。使用贴壁法，我们平均获得了 2.6 x 1012 个基因组拷贝 （GC），而悬浮法和聚乙烯亚胺总共产生了 7.7 x 1012 GC，TransIt 总共产生了 2.4 x 1013 GC。与悬浮细胞系统相比，贴壁细胞产生的载体之间的 体内 转导效率没有差异。总之，引入了基于悬浮 HEK293 细胞的 AAV 生产方案，从而减少了载体生产所需的时间和劳动力，同时使用商业供应商提供的用于研究目的的组件实现了 3 至 9 倍的产量。
Introduction
腺相关病毒 （AAV） 于 1965 年被发现，此后被用于无数应用1。AAV 已应用于神经科学研究，以研究基因和神经元功能、绘制神经回路或生成疾病2 的动物模型。传统上，这是通过直接在感兴趣的部位注射来完成的，因为大多数天然血清型不会穿过血脑屏障或需要高剂量才能这样做 1,2,3。
随着AAV的发现。PHP.B4 和下一代衣壳，如 AAV。PHP.eB5 和 AAV.CAP-B106，可以使用简单的全身注射来靶向中枢神经系统（CNS）。空间映射揭示了AAV靶向的细胞。PHP.eB 在细胞水平 6,7.这些衣壳与特定的启动子/增强子相结合，为神经科学家提供了广泛的机会，通过非侵入性 AAV 递送来研究基因和大脑功能 4,8。
而 AAV 需要较低的剂量。PHP.eB（通常为 1 至 5 x 1011 个基因组拷贝 （GC）/小鼠）与 AAV9（4 x 1012 GC/小鼠）7 相比，与直接进样策略（通常为 1 x 109 GC/μL 进样）相比，仍需要产生更多的载体。大多数天然血清型可以使用经典贴壁细胞培养系统结合碘克沙醇纯化9,10,11,12来生产。对于 AAV。PHP.eB 这需要一个劳动密集型的过程来培养和转染细胞，以获得足够的载体进行一次实验8。因此，开发了在锥形管中悬浮细胞培养中生产AAV。锥形管容量高达 300 mL，结构紧凑，既节省了培养箱空间，又节省了塑料。悬浮细胞比 15 cm 板上的贴壁细胞更容易大量培养和处理。实验方案的转染成分保持不变。因此，先前与贴壁系统一起使用的质粒可以很容易地用于基于悬浮细胞中生产的该方案。该方案已成功转移给实验室中的其他研究人员，并成功用于各种衣壳和构建体。
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV的全身给药是基因转移到中枢神经系统的有力工具;然而，AAV的生产是一个昂贵而费力的过程。通过使用悬浮细胞，与在 15 cm2 板上贴壁培养HEK293T相比，减少了劳动力和塑料。此外，这里采用的锥形管易于操作，并最大限度地利用了实验室空间。该协议由两名研究人员制定，随后由实验室中的其他人应用。三位独立研究人员的一系列生产平均每批产生足够的载体来注射6-7只小鼠。
<p cl…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了荷兰皇家艺术与科学学院（KNAW）研究基金的资助和Start2Cure（0-TI-01）的资助。我们感谢 Leisha Kopp 在协议设置中提供的意见和建议。图是使用Biorender创建的。
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Riferimenti
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