Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293
Summary
Aquí, se presenta un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que resulta en una reducción del tiempo y la mano de obra necesarios para la producción de vectores utilizando componentes que están disponibles para fines de investigación de proveedores comerciales.
Abstract
Los vectores virales adenoasociados (AAV) son una herramienta notable para investigar el sistema nervioso central (SNC). Cápsidas innovadoras, como AAV. PHP.eB, demuestran una transducción extensa del SNC por inyección intravenosa en ratones. Para lograr una transducción comparable, se necesita un título 100 veces mayor (mínimo 1 x 1011 copias del genoma por ratón) en comparación con la inyección directa en el parénquima del SNC. En nuestro grupo, la producción de AAV, incluido el AAV. PHP.eB se basa en células HEK293T adherentes y en el método de triple transfección. Lograr altos rendimientos de AAV con células adherentes implica un proceso intensivo en mano de obra y materiales. Esta limitación impulsó el desarrollo de un protocolo para el cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los AAV generados en las células adherentes se compararon con el método de producción en suspensión. Se compararon cultivos en suspensión utilizando reactivos de transfección Polietilenimina o TransIt. Los vectores AAV se purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de yodixanol, seguida de intercambio de tampón y concentración mediante un filtro centrífugo. Con el método adherente, logramos un promedio de 2.6 x10 12 copias del genoma (GC) en total, mientras que el método de suspensión y la polietilenimina produjeron 7.7 x 1012 GC en total, y TransIt produjo 2.4 x 1013 GC en total. No hay diferencia en la eficiencia de transducción in vivo entre los vectores producidos con adherente en comparación con el sistema de celdas de suspensión. En resumen, se introduce un protocolo de producción de AAV basado en células HEK293 en suspensión, lo que da como resultado una menor cantidad de tiempo y mano de obra necesaria para la producción de vectores, al tiempo que se logran rendimientos de 3 a 9 veces mayores utilizando componentes disponibles de proveedores comerciales con fines de investigación.
Introduction
El virus adenoasociado (AAV) fue descubierto en 1965 y desde entonces se ha utilizado en una gran cantidadde aplicaciones. Los AAV se han aplicado en la investigación neurocientífica para estudiar la función génica y neuronal, mapear neurocircuitos o producir modelos animales para enfermedades2. Tradicionalmente, esto se hace inyectando directamente en el sitio de interés, ya que la mayoría de los serotipos naturales no atraviesan la barrera hematoencefálica ni necesitan una dosis alta para hacerlo 1,2,3.
Con el descubrimiento de AAV. PHP.B4 y cápsidas de última generación como AAV. PHP.eB5 y AAV. CAP-B106, es posible dirigirse al sistema nervioso central (SNC) mediante una simple inyección sistémica. El mapeo espacial revela las células a las que se dirige AAV. PHP.eB a nivel celular 6,7. En combinación con promotores/potenciadores específicos, estas cápsidas ofrecen amplias oportunidades para que los neurocientíficos estudien los genes y la función cerebral mediante la administración no invasiva de AAV 4,8.
Mientras que se necesita una dosis más baja para AAV. PHP.eB (típicamente 1 a 5 x 1011 copias del genoma (GC)/ratón) en comparación con AAV9 (4 x 1012 GC/ratón)7, aún se necesita producir más vector en comparación con las estrategias de inyección directa (típicamente inyección de 1 x 109 GC/μL). La mayoría de los serotipos naturales se pueden producir utilizando el sistema clásico de cultivo celular adherente en combinación con la purificación de yodixanol 9,10,11,12. Para AAV. PHP.eB Esto implica un proceso laborioso de cultivo y transfectación de células para obtener suficientes vectores para un experimento8. Por lo tanto, se desarrolló la producción de AAV en cultivo celular en suspensión en tubos cónicos. Los tubos cónicos, con una capacidad de hasta 300 ml, son compactos, lo que ahorra espacio en la incubadora y plásticos. Las células en suspensión son mucho más fáciles de cultivar y manipular en grandes cantidades que las células adherentes en placas de 15 cm. Los componentes de transfección del protocolo siguen siendo los mismos. Por lo tanto, los plásmidos utilizados previamente con el sistema adherente pueden utilizarse fácilmente en este protocolo basado en la producción en células en suspensión. El protocolo se transfirió con éxito a otros investigadores en el laboratorio y se utilizó con éxito para varias cápsidas y construcciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
La administración sistémica de AAV es una herramienta poderosa para la transferencia de genes al SNC; sin embargo, la producción de AAV es un proceso costoso y laborioso. Mediante el uso de celdas de suspensión, se reduce la mano de obra y los plásticos en comparación con el cultivo adherente de HEK293T en placas de 15cm2 . Además, los tubos cónicos implementados aquí son fáciles de manejar y maximizan el uso del espacio del laboratorio. El protocolo fue establecido por dos investigadores y posterior…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de una beca del fondo de investigación de la Real Academia de las Artes y las Ciencias de los Países Bajos (KNAW) y una subvención de Start2Cure (0-TI-01). Agradecemos a Leisha Kopp por sus aportes y consejos en la configuración del protocolo. Las figuras fueron creadas con Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
Riferimenti
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