Modelos de cultivo celular tridimensional para investigar la barrera epitelial en la esofagitis eosinofílica
Summary
Aquí, se proporciona un protocolo para el cultivo de organoides esofágicos humanos y el cultivo de interfaz aire-líquido. El cultivo de la interfaz aire-líquido de los organoides esofágicos se puede utilizar para estudiar el impacto de las citocinas en la barrera epitelial esofágica.
Abstract
El epitelio escamoso del esófago está expuesto directamente al medio ambiente, enfrentándose continuamente a antígenos extraños, incluidos antígenos alimentarios y microbios. Mantener la integridad de la barrera epitelial es fundamental para prevenir infecciones y evitar la inflamación causada por antígenos inofensivos derivados de los alimentos. Este artículo proporciona protocolos simplificados para generar organoides esofágicos humanos y cultivos de interfaz aire-líquido a partir de biopsias de pacientes para estudiar el compartimento epitelial del esófago en el contexto de la homeostasis tisular y la enfermedad. Estos protocolos han sido hitos científicos importantes en la última década, ya que describen estructuras tridimensionales similares a órganos a partir de células primarias derivadas de pacientes, organoides y cultivos de interfaz aire-líquido. Ofrecen la posibilidad de investigar la función de citocinas específicas, factores de crecimiento y vías de señalización en el epitelio esofágico dentro de un marco tridimensional, manteniendo las propiedades fenotípicas y genéticas del donante. Los organoides proporcionan información sobre la microarquitectura de los tejidos mediante la evaluación del transcriptoma y el proteoma después de la estimulación de citocinas. Por el contrario, los cultivos de interfaz aire-líquido permiten evaluar la integridad de la barrera epitelial a través de la resistencia transepitelial (TEER) o mediciones de flujo de macromoléculas. La combinación de estos organoides y los cultivos de interfaz aire-líquido es una herramienta poderosa para avanzar en la investigación en condiciones de barrera epitelial esofágica deteriorada.
Introduction
La inflamación esofágica compromete la integridad de la barrera epitelial 1,2,3,4,5, como se observa en la esofagitis eosinofílica (EoE), una enfermedad inflamatoria crónica del esófago dominada por Th26. La EoE se describió por primera vez en la década de 1990 7,8 y es inducida predominantemente por antígenos alimentarios 9,10,11,12,13. Los síntomas más frecuentes de la EoE en la población adulta son la disfagia y la impactación alimentaria14. En los niños, la EoE se manifiesta típicamente con retraso del crecimiento, rechazo de alimentos, vómitos y dolor abdominal15. Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS, por sus siglas en inglés) han identificado genes de riesgo de EoE involucrados en la integridad de la barrera epitelial, lo que ha llevado al epitelio al foco de la investigación de EoE 16,17,18. La transcriptómica de EoE reveló además que un proceso de diferenciación alterado y una hiperplasia reactiva de la zona basal causan el compromiso de la función barrera del epitelio esofágico 3,5,19,20,21,22. La comprensión temprana de que la EoE esuna enfermedad mediada por Th2 6 condujo al descubrimiento de la IL-13 como mediador impulsor al perturbar la integridad epitelial 3,4,21,23. Los sistemas experimentales que permiten la disección de los efectos mediados por citocinas sobre la integridad epitelial a partir del deterioro de la barrera intrínseca a través de la predisposición genética brindan la posibilidad de estudiar la compleja interacción entre las células inmunitarias y el epitelio en EoE. Los organoides esofágicos humanos y los cultivos de interfaz aire-líquido (ALI) han sido propuestos como herramientas valiosas para analizar las consecuencias de la estimulación de citocinas sobre la integridad epitelial5.
El primer protocolo para generar organoides esofágicos derivados de células madre específicas de tejido adulto (ASC) se estableció cinco años después de los primeros informes publicados de organoides intestinales en 2009 utilizando ASC intestinales Lgr5+ que recapitulan el compartimento epitelial del intestino delgado24. DeWard et al. fueron pioneros en la generación de organoides a partir de células epiteliales esofágicas murinas25. En 2018, Kasagi et al. generaron organoides esofágicos humanos a partir de la línea celular inmortalizada de epitelio escamoso esofágico humano EPC2-hTERT y células primarias derivadas de pacientes26. En el mismo año, Zhang et al. generaron con éxito organoides esofágicos derivados de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Delinearon la importancia de la inhibición de TGFβ y de la proteína morfogenética ósea (BMP) para el desarrollo de células progenitoras esofágicas (EPC) y el papel crucial de la señalización de Notch en la diferenciación del epitelio escamoso estratificado26,27. Trisno y sus colegas complementaron estos hallazgos identificando a Sox2 como un inhibidor de Wnt que dirige el destino del desarrollo hacia la diferenciación esofágica28. Los posteriores refinamientos de los protocolos, la composición del medio y las condiciones de cultivo aumentaron la tasa de formación de organoides e hicieron posible el subcultivo y la recuperación de organoides después de la criopreservación 26,29,30,31,32. Aunque estos organoides son herramientas poderosas para estudiar la arquitectura de los tejidos y la expresión de posibles genes diana después de la estimulación con citocinas, los organoides esofágicos no ofrecerán la posibilidad de medir la resistencia transepitelial (TEER) o el flujo de macromoléculas como medidas directas para la integridad de la barrera. Como se describió previamente por Sherrill y colaboradores22, los cultivos ALI que modelan la diferenciación epitelial4 permiten evaluaciones directas de la integridad epitelial. La combinación de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI es una herramienta poderosa para investigar la arquitectura de los tejidos y la integridad de la barrera epitelial en la EoE.
A continuación, se presentan procedimientos con instrucciones para aislar células viables de biopsias esofágicas y establecer cultivos de organoides esofágicos y ALI que se pueden utilizar para estudiar los efectos de las citocinas en la integridad de la barrera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procedimientos proporcionados permiten el cultivo de organoides derivados de pacientes y cultivos de ALI con altas perspectivas de éxito. El protocolo de organoides ha sido adaptado del primer protocolo publicado que informa de la generación de organoides esofágicos humanos26 y de un protocolo recientemente publicado32. Sherill y sus colegas han descrito el modelo ALI22. Los organoides y los modelos de cultivo de ALI se ayudan mutuamente en el…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La subvención 310030_219210 de la SNSF a J.H.N. apoyó la publicación de este manuscrito sin restricciones. La figura 1 se ha creado con la ayuda de BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
Riferimenti
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