Modèles de culture cellulaire tridimensionnels pour étudier la barrière épithéliale dans l’œsophagite à éosinophiles
Summary
Ici, un protocole pour la culture d’organoïdes œsophagiens humains et la culture d’interface air-liquide est fourni. La culture de l’interface air-liquide des organoïdes œsophagiens peut être utilisée pour étudier l’impact des cytokines sur la barrière épithéliale œsophagienne.
Abstract
L’épithélium squameux de l’œsophage est directement exposé à l’environnement, faisant continuellement face à des antigènes étrangers, y compris des antigènes alimentaires et des microbes. Le maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale est essentiel pour prévenir les infections et éviter l’inflammation causée par des antigènes inoffensifs d’origine alimentaire. Cet article fournit des protocoles simplifiés pour générer des organoïdes œsophagiens humains et des cultures d’interface air-liquide à partir de biopsies de patients afin d’étudier le compartiment épithélial de l’œsophage dans le contexte de l’homéostasie tissulaire et de la maladie. Ces protocoles ont constitué des jalons scientifiques importants au cours de la dernière décennie, décrivant des structures tridimensionnelles ressemblant à des organes à partir de cellules primaires dérivées de patients, d’organoïdes et de cultures d’interface air-liquide. Ils offrent la possibilité d’étudier la fonction de cytokines, de facteurs de croissance et de voies de signalisation spécifiques dans l’épithélium de l’œsophage dans un cadre tridimensionnel tout en conservant les propriétés phénotypiques et génétiques du donneur. Les organoïdes fournissent des informations sur la microarchitecture tissulaire en évaluant le transcriptome et le protéome après stimulation par cytokines. En revanche, les cultures d’interface air-liquide permettent d’évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale par des mesures de résistance transépithéliale (TEER) ou de flux de macromolécules. La combinaison de ces organoïdes et des cultures d’interface air-liquide est un outil puissant pour faire avancer la recherche sur les altérations de la barrière épithéliale œsophagienne.
Introduction
L’inflammation de l’œsophage compromet l’intégrité de la barrière épithéliale 1,2,3,4,5, comme observé dans l’œsophagite à éosinophiles (EoE), une maladie inflammatoire chronique de l’œsophage6 dominée par Th2. L’œsophage à éosinophile a été décrit pour la première fois dans les années 1990 7,8 et est principalement induit par des antigènes alimentaires 9,10,11,12,13. Les symptômes les plus fréquents de l’œsophage à éosinophiles dans la population adulte sont la dysphagie et la fématologie alimentaire14. Chez les enfants, l’œsophage à éosinophile se manifeste généralement par un retard de croissance, un refus de nourriture, des vomissements et des douleurs abdominales15. Les études d’association à l’échelle du génome (GWAS) ont identifié des gènes de risque d’œsophage à éosinophile impliqués dans l’intégrité de la barrière épithéliale, plaçant l’épithélium au centre de la recherche sur l’œstroïdeà éosinophiles 16,17,18. La transcriptomique de l’EoE a en outre révélé qu’un processus de différenciation altéré et une hyperplasie réactive de la zone basale sont à l’origine de la fonction barrière compromise de l’épithélium œsophagien 3,5,19,20,21,22. La compréhension précoce de l’œsophagite à éosinophile comme étant une maladie médiée par Th26 a conduit à la découverte de l’IL-13 en tant que médiateur moteur en perturbant l’intégrité épithéliale 3,4,21,23. Les systèmes expérimentaux permettant de dissectionr les effets médiés par les cytokines sur l’intégrité épithéliale à partir d’une altération de la barrière intrinsèque par prédisposition génétique offrent la possibilité d’étudier l’interaction complexe entre les cellules immunitaires et l’épithélium dans l’œsophage à éosinophiles. Des organoïdes œsophagiens humains et des cultures d’interface air-liquide (ALI) ont été proposés comme des outils précieux pour analyser les conséquences de la stimulation des cytokines sur l’intégrité épithéliale5.
Le premier protocole de génération d’organoïdes œsophagiens dérivés de cellules souches spécifiques aux tissus (ASC) adultes a été établi cinq ans après les premiers rapports publiés sur les organoïdes intestinaux en 2009 utilisant des ASC intestinales Lgr5+ récapitulant le compartiment épithélial de l’intestin grêle24. DeWard et al. ont été les pionniers de la génération d’organoïdes à partir de cellules épithéliales œsophagiennesmurines 25. En 2018, Kasagi et al. ont généré des organoïdes œsophagiens humains à partir de la lignée cellulaire épithéliale épidermoïde de l’œsophage humain immortalisée EPC2-hTERT et de cellules primaires dérivées de patients26. La même année, Zhang et al. ont réussi à générer des organoïdes œsophagiens dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ils ont souligné l’importance de l’inhibition du TGFβ et de la protéine morphogénétique osseuse (BMP) pour le développement des cellules progénitrices de l’œsophage (EPC) et le rôle crucial de la signalisation Notch dans la différenciation de l’épithélium épidermoïde stratifié26,27. Trisno et ses collègues ont complété ces résultats en identifiant Sox2 comme un inhibiteur de Wnt qui oriente le destin du développement vers la différenciation œsophagienne28. Les améliorations ultérieures des protocoles, de la composition du milieu et des conditions de culture ont augmenté le taux de formation d’organoïdes et ont rendu possible la sous-culture et la récupération d’organoïdes après cryoconservation 26,29,30,31,32. Bien que ces organoïdes soient des outils puissants pour étudier l’architecture tissulaire et l’expression de gènes cibles potentiels après stimulation par des cytokines, les organoïdes œsophagiens n’offriront pas la possibilité de mesurer la résistance transépithéliale (TEER) ou le flux de macromolécules comme mesures directes de l’intégrité de la barrière. Comme décrit précédemment par Sherrill et ses collègues22, les cultures ALI modélisant la différenciation épithéliale4 permettent des évaluations directes de l’intégrité épithéliale. La combinaison d’organoïdes dérivés de patients et de cultures ALI est un outil puissant pour étudier l’architecture tissulaire et l’intégrité de la barrière épithéliale dans l’œsémination à éosinophiles.
Voici des procédures avec des instructions pour isoler des cellules viables à partir de biopsies œsophagiennes et établir des cultures d’organoïdes œsophagiens et d’ALI qui peuvent être utilisées pour étudier les effets des cytokines sur l’intégrité de la barrière.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les procédures fournies permettent la culture d’organoïdes dérivés de patients et de cultures ALI avec de fortes chances de succès. Le protocole des organoïdes a été adapté à partir du premier protocole publié rapportant la génération d’organoïdes œsophagiens humains26 et d’un protocole récemment publié32. Sherill et ses collègues ont décrit le modèleALI 22. Les organoïdes et les modèles de culture ALI s’entraident dans …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La subvention FNS 310030_219210 accordée à J.H.N. a soutenu la publication de ce manuscrit sans restriction. La figure 1 a été créée à l’aide de BioRender.com.
Materials
| 1250 µL Griptip – Filter | Integra | 4445 | |
| 300 µL Griptip – Filter | Integra | 4435 | |
| 70 µM cell strainer | Sarstedt | 83.3945.070 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich (Merck) | A4544 | |
| Bovine pituitary extract | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | |
| Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures | Greiner Bio-One | 7.657 185 | |
| Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear | R&D Systems (Bio-Techne) | 3532-010-02 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade | Carl Roth | A994 | |
| Dispase I | Corning | 354235 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich (Merck) | D4693 | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich (Merck) | D8537 | |
| EVE Automated Cell Counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| EVE Cell counting slide | NanoEntek | EVS-050 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Falcon | 352235 | |
| Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran | Sigma-Aldrich (Merck) | FD4 | average mol wt 3000-5000 |
| Heraeus – Megafuge 40R | Thermo Fisher Scientific | 75004518 | |
| Human recombinant epidermal growth factor | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 3700015 | |
| Keratinocyte-SFM | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 17005042 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermo Fischer Scientific) | 15140122 | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein | R&D Systems (Bio-Techne) | 251-KG-010/CF | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Single Channel EVOLVE 100-1000 µL | Integra | 3018 | |
| Single Channel EVOLVE 20-200 µL | Integra | 3016 | |
| Syringe 1 mL | 1134950 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich (Merck) | T9128 | |
| Trypsin-EDTA | SAFC Biosciences (Merck) | 59418C | |
| Y27632 dihydrochloride | Tocris (Bio-Techne) | 1254 |
Riferimenti
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