从冷冻保存的体外来源血细胞中进行核分离

造血是一个相对特征明确的发育系统，但无法在体外概括血细胞的形成表明对相关因素的理解不完整。基于诱导多能干细胞 （iPSC） 的造血模型可以帮助阐明关键的发育因素和相关生物学。iPSC 系统还为研究血液疾病提供了出色的模型，并且基于 iPSC 的血细胞已被开发用于产生转化和治疗相关的试剂 1,2,3,4。单细胞研究已被广泛用于研究基于 iPSC 的发育生物学，包括造血过程中产生的细胞类型⁵。与无法推断细胞亚群之间关系的批量RNA测序6^相比，单细胞模式允许评估细胞异质性，并有助于细胞发育的鉴定和表征^6,7。

iPSCs造血细胞的形成需要通过原始条纹、中胚层和内皮状态进行顺序分化，以形成成血性内皮细胞。成血内皮细胞是造血干细胞和祖细胞的直接前体细胞⁸。这些细胞类型具有截然不同的形态和细胞特性。对 体外衍生造血细胞模型的表观遗传学景观和发育动力学的理解有限，尽管这是释放 iPSC 系统全部治疗潜力的基本知识。在许多情况下，只有单细胞分析模式才能鉴定细胞群、转录活性、染色质景观和调节机制，这些都控制着异质细胞制备物的发育。

单细胞 RNA 测序 （scRNAseq） 和单核 RNA 测序 （snRNAseq） 这两种方法可以揭示单个细胞水平的转录见解⁹。决定数据有效性和可靠性的一个主要因素是对满足严格质量标准的样品的坚定需求。其中包括对细胞/细胞核密度的精确要求、最佳活力和最小聚集。单核的制备在技术上可能具有挑战性。使用先前冷冻保存的细胞可能会带来额外的挑战。

我们注意到标准scRNAseq方法的四个重要的潜在局限性。首先，用于生成细胞悬液的标准方案通常参考来自新鲜细胞或组织的制剂，而不是冷冻保存后提取的制剂¹⁰。这可能会削弱潜在宝贵资源的效用。其次，不同细胞类型的解离效率是可变的。例如，许多免疫细胞类型相对容易地发生解离。相比之下，通常嵌入细胞外基质和基底膜中的基质细胞、成纤维细胞和内皮细胞具有独特的细胞特性，可能会使细胞核分离复杂化^11,12。这些特性可能需要积极的解离方案，这可能会危及更脆弱的细胞群的结构完整性。第三，一些细胞（例如，巨核细胞）的直径可以超过100μm，这给几个现有的商业单细胞平台带来了困难¹³。此外，在细胞分离的初始步骤中，处理不当会导致细胞损伤和应激反应，包括酶水解和机械解离，这会影响基因表达谱^11,14。

由于这些原因和其他原因，单细胞核方法可能是单细胞方法的更可取的替代方案¹⁵。鉴于与细胞膜相比，核膜具有优越的稳定性，即使在组织冷冻保存后，核膜也可能保持完整¹⁶。这可以促进细胞核提取，并增强适合下一代测序模式的样本类型的多样性。其次，细胞核对机械扰动表现出更强的抵抗力，并且在解离过程中往往表现出较少的转录位移¹⁴。因此，细胞核可以提供更高的 RNA 稳定性和更可重复的转录谱。单核方法的第三个值得注意的优点是没有细胞大小限制，并且适用于较大的细胞，如心肌细胞或巨核细胞¹²。第四，细胞核是多组学分析的合适底物，通过对基因表达、可访问染色质区域和其他参数的综合分析，可以提供更多的见解¹⁷，从而能够更深入地理解细胞异质性、发育和功能状态¹⁸。

通过在造血发育过程中分析iPSCs，多组学方法可以帮助定义正常或病理疾病模型中的发育过程。将 iPSC 衍生细胞与原代细胞或组织进行比较还可以评估 iPSC 模型对 体内 生物学的保真度，从而促进 iPSC 模型的改进和发现新的细胞群和驱动血液形成的因素。

尽管许多研究小组已经成功地进行了核分离和由此产生的下一代测序分析，但对于一些有兴趣进行基于单核分析的实验室来说，分离出高质量的细胞核仍然是一个障碍。该手稿详细介绍了从先前冷冻保存的 iPSC 衍生细胞中分离优质细胞核的方案。我们专注于贴壁基质/内皮细胞和非贴壁造血祖细胞，因为它们在结构和内容方面代表了非常不同的细胞类型，需要进行定制的修饰和故障排除，以提高适合下一代测序或其他实验的高质量细胞核的回收率。