Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

A promessa de terapias genéticas mediadas por vírus foi finalmente realizada nos últimos anos com a aprovação do FDA de tratamentos para atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana, hemofilia do fator IX, câncer e muito mais 1,2,3,4. Inúmeras outras terapias estão atualmente em desenvolvimento. A terapia gênica visa fornecer um gene terapêutico às células de um paciente. Os produtos desse novo gene podem substituir a atividade ausente de um gene endógeno deficiente, inibir um gene tóxico, matar células cancerígenas ou fornecer alguma outra função benéfica.

Para doenças que afetam o sistema nervoso central (SNC), a entrega do vetor de terapia gênica diretamente ao tecido-alvo é frequentemente desejável. As abordagens não sistêmicas oferecem dois benefícios: minimizam os efeitos colaterais fora do alvo que podem ser causados pela transdução periférica e reduzem muito a quantidade de vetor necessária para atingir níveis adequados de transdução no tecido-alvo⁵.

Há uma variedade de abordagens para fornecer vetores de terapia gênica ao SNC. A injeção intraparenquimatosa, a injeção de um vetor diretamente na medula espinhal ou no tecido cerebral, pode ser usada para entrega em uma região definida. No entanto, para muitas doenças, a transdução ampla do SNC é desejada. Isso pode ser feito entregando um vetor ao líquido cefalorraquidiano (LCR)⁵, o fluido que flui dentro e ao redor do cérebro e da medula espinhal. Existem três maneiras principais de fornecer vetores ao LCR. A abordagem mais invasiva é a entrega intracerebroventricular, que envolve a perfuração de um orifício no crânio e o avanço de uma agulha através do cérebro até os ventrículos laterais. Isso produz transdução por todo o cérebro. No entanto, o procedimento pode causar hemorragia intracraniana, e a abordagem geralmente produz apenas transdução limitada da medula espinhal⁶. A injeção na cisterna magna na base do crânio é menos invasiva, mas traz o risco de danos ao tronco cerebral. Embora frequentemente usada em pesquisas com animais⁵, a injeção na cisterna magna não é mais usada rotineiramente na clínica⁷. A punção lombar é a abordagem menos invasiva para acessar o LCR. Isso envolve colocar uma agulha entre duas vértebras lombares e na cisterna lombar.

A punção lombar para entrega do vetor é realizada rotineiramente em ratos e camundongos adultos e em camundongos neonatais ^8,9. Os autores deste estudo realizaram recentemente punções lombares em ratos juvenis (28-30 dias de idade) para fornecer vetores do sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9). Em ratos adultos, uma agulha de punção lombar neonatal foi colocada verticalmente entre as vértebras L3 e L4⁹. O posicionamento adequado resulta em um movimento da cauda e no LCR fluindo para o reservatório da agulha. Em ratos juvenis, porém, nenhuma dessas leituras pôde ser alcançada. Os autores então tentaram adaptar um procedimento de camundongo adulto usando uma seringa de insulina 27 G inserida em um ângulo entre L5 e L6¹⁰. Em camundongos adultos, que normalmente são menores que os ratos P28, isso não produz um movimento da cauda, mas a colocação incorreta da agulha é evidente pelo refluxo do injetado. Em ratos juvenis, no entanto, essa abordagem levou uniformemente ao injetado ser administrado por via epidural, provavelmente resultante de diferentes elasticidades entre camundongos adultos e ratos juvenis das camadas de tecido ao redor da medula espinhal. As abordagens por cateter foram avaliadas em seguida. Especificamente, um cateter foi introduzido através de uma incisão na dura-máter da cisterna lombar e até a medula espinhal torácica média; no entanto, essa abordagem levou a um refluxo substancial do injetado de volta para fora do local da incisão durante o parto. As tentativas de colocar o cateter no espaço intratecal por via percutânea com agulha-guia também não tiveram sucesso. Devido à estreiteza da largura interlaminar, o cateter provavelmente atingiria a lâmina rostral e não avançaria.

Aqui, é descrito um método para obter uma entrega de solução bem-sucedida e reprodutível por meio de uma punção lombar no rato juvenil. Essa abordagem pode ser usada para vetores virais e, provavelmente, também para células, produtos farmacêuticos e outras terapêuticas.