该协议提出了一种详细的方法,用于复制高脂血症诱导的射血分数保留(HFpEF)的小鼠模型。该设计结合了腺相关病毒 9-心肌肌钙蛋白 T 低密度脂蛋白受体 (AAV9-cTnT-LDLR) 和泊洛沙姆-407 (P-407) 的给药。
由脂毒性驱动的射血分数保留型心力衰竭 (HFpEF) 的病理生理学尚不清楚。鉴于迫切需要准确模拟心脏代谢 HFpEF 的动物模型,通过对 HFpEF 患者中看到的表型进行逆向工程,开发了一种高脂血症诱导的小鼠模型。该模型旨在研究 HFpEF,重点关注脂毒性与代谢综合征之间的相互作用。通过每两周腹膜内注射泊洛沙姆-407 (P-407),一种阻断脂蛋白脂肪酶的嵌段共聚物,结合单次静脉注射腺相关病毒 9-心肌肌钙蛋白 T-低密度脂蛋白受体 (AAV9-cTnT-LDLR),在 129J 菌株背景的野生型 (WT) 小鼠中诱导高脂血症。在治疗后 4 至 8 周之间进行了广泛的评估,包括超声心动图、血压记录、全身体积描记法、超声心动图 (ECG) 遥测、活动轮监测 (AWM) 以及生化和组织学分析。LDLR/P-407小鼠在4周时表现出明显的特征,包括舒张功能障碍、射血分数保留和左心室壁厚度增加。值得注意的是,血压和肾功能保持在正常范围内。此外,ECG 和 AWM 分别显示心脏阻滞和活动减少。舒张功能在八周时恶化,伴有呼吸频率显着下降。对双重治疗模型的进一步研究揭示了纤维化、湿/干肺比值和心脏重量/体重比值升高。LDLR/P-407小鼠表现出黄瘤、腹水和心肌缺血。有趣的是,猝死发生在治疗后 6 到 12 周之间。小鼠 HFpEF 模型为阐明在脂毒性介导的 HFpEF 背景下导致舒张功能障碍的代谢综合征的复杂性提供了一种有价值且有前途的实验资源。
射血分数保留型心力衰竭 (HFpEF) 是指伴有多种合并症的心脏代谢综合征,占所有心力衰竭病例的 50% 以上 1,2。此外,HFpEF 的频率在过去十年中稳步上升3.由于治疗选择有限,鉴于其多方面的病理生理学,HFpEF 代表了心血管疾病中最重要的未满足的医疗需求4。因此,迫切需要加强对 HFpEF 潜在机制和病理生理学的理解,以开发有效的治疗方法。
尽管近年来取得了重大进展,但归因于脂毒性的 HFpEF 的病理生理学仍然不完全清楚。已经确定,与射血分数降低的心力衰竭 (HFrEF) 和对照健康对照者相比,HFpEF 患者表现出显着的心肌脂质积累5。心脏活检的 RNA 测序数据显示,与健康和 HFrEF 患者相比,HFpEF 组的脂蛋白脂肪酶 (LPL) 基因下调6。Poloxamer-407 (P-407) 是一种嵌段共聚物,通过阻断 LPL 并随后增加血浆甘油三酯和低密度脂蛋白 (LDL) 胆固醇来诱导高脂血症7。先前的研究表明,HFpEF 小鼠心脏中的 LDL 受体 (LDLR) 表达很高8。
基于这些发现,并认识到迫切需要准确模拟心脏代谢HFpEF的动物模型,开发并提出了高脂血症诱导的小鼠模型。该模型是为探索 HFpEF 而量身定制的,明确关注脂毒性与代谢综合征的参与。在高脂血症/LPL阻断和增强心脏LDLR表达的诱导下,通过每两周腹膜内(ip)注射P-407结合单次静脉注射腺相关病毒9-心肌肌钙蛋白T-LDLR(AAV9-cTnT-LDLR)9,在129J背景的WT-129小鼠中建立了该模型。
在治疗后 4 至 8 周之间,进行了一系列广泛的评估,包括超声心动图、血压记录、全身体积描记法 (WBP)、连续心电图 (ECG) 遥测、活动轮监测 (AWM) 以及生化和组织学分析9。在四周时,LDLR/P407 或“双重治疗”小鼠表现出明显的 HFpEF 特征,包括舒张功能障碍、射血分数保留和左心室壁厚度增加9。此外,心电图遥测和 AWM 分别显示心脏阻滞和活动减少。值得注意的是,血压和肾功能保持正常9.到八周时,舒张功能恶化,WBP 测量结果显示呼吸频率降低9。
对双重治疗模型的进一步探索揭示了纤维化、湿/干肺比值升高和心脏重量/体重比值9。尸检发现腹水、心肌缺血和黄瘤。有趣的是,在治疗后 6 到 12 周之间记录了猝死9。这种小鼠高脂血症驱动的 HFpEF 模型提供了一种快速、有价值且有前途的实验工具,用于揭示代谢综合征的复杂性,这些综合征会导致脂毒性介导的 HFpEF 舒张功能障碍。
尽管 HFpEF 的患病率在过去十年中稳步上升,但对潜在病理生理学的具体理解仍然难以捉摸13.此外,截至目前,存在有限的循证疗法13.提高对心脏代谢 HFpEF 所涉及的机制的理解是必要的。此前,引入了一种高脂血症小鼠模型,该模型模拟 HFpEF,既不是慢性肾脏病 (CKD),也不是心脏 LDLR OE 和 p407 注射诱导的高血压9。
研究结果显示,心脏 LDLR OE 和高脂血症的组合在 4 周后导致小鼠舒张功能障碍、心律失常、左心室 (LV) 肥大、运动不耐受、心脂积累和纤维化,如前所述9。还观察到这些小鼠的心脏、肝脏和骨骼肌中低密度脂蛋白胆固醇摄取增加,心脏和肝脏中甘油三酯降低9。该方法的优点在于其研究心脏代谢综合征途径的快速性,与其他高脂血症HFpEF小鼠模型相比,这些途径尚未得到很好的理解,例如高脂饮食(HFD)需要长达16周和20周才能发育14。该模型需要四周时间开发,并模仿人类的代谢异常。因此,该模型的可重复性至关重要。
当务之急是确保AAV9-cTnT-LDLR和P-407的彻底准备和管理。该模型的可复制性高度依赖于 P-407 和 AAV9-cTnT-LDLR 浓度和剂量的准确计算,以及重量测量。同样重要的是溶液制备和适当的静脉内和腹膜内注射技术。这些技术的偏差可能会导致重大的改变和不希望的结果。
尽管这种模型具有有效性和效率,但仍存在一些局限性。进行静脉注射和腹膜内注射需要严格的培训。此外,静脉注射和频繁腹膜内注射存在潜在的发病和死亡风险。进行静脉注射时可能会导致小鼠尾部损伤,而腹膜内注射时可能会发生盲肠穿刺,从而导致腹膜炎15。这些伤害通常是由于不正确的技术造成的,并可能导致实验对象和治疗的损失。因此,在执行这些程序之前,有必要进行广泛的培训。另一个限制是该模型将重点放在 129J 菌株上。选择 129J 菌株的基本原理源于初步研究,与我们最初在未发表的研究中研究的 C57BL/6 小鼠相比,该菌株的舒张功能障碍和 HFpEF 发现更快。
无论这些局限性如何,该模型将允许更快速地研究HFpEF涉及的潜在机制和潜在的有效治疗方案。先前的研究已经导致心脏代谢 HFpEF 诱导的 HFD 和 N[w]-硝基-l-精氨酸甲酯 (L-NAME) 在 5-15 周内的病理生理学模型的发展13.然而,由于 HFpEF 患病率的稳步上升,迫切需要进一步了解心脏代谢性 HFpEF 的病理生理学并开发有效的治疗方法。这种心脏 LDLR OE 和 p407 诱导的高脂血症的小鼠模型是一种快速可行的诱导心脏代谢 HFpEF 的方法,用于未来的研究工作。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢 Penncore 和 NHLBI 基因治疗资源计划 (GTRP) 资助该项目中使用的腺相关病毒的生成。这项研究由美国国立卫生研究院 (NIH) (1R01HL140468) 和迈阿密心脏研究所向 LS 提供的资助。MW 是 2020 年至 2022 年 NIH 多样性补充奖 (R01HL140468- 03S1) 的获得者。JH 由 1R01 HL13735、1R01 HL107110、5UM1 HL113460、1R01 HL134558、5R01 CA136387(来自美国国立卫生研究院)、W81XWH-19-PRMRPCTÀ(来自国防部)以及 Starr、Lipson 和 Soffer 家庭基金会资助。
Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR) | U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP) | Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp). | |
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400 | (VisualSonics, Toronto, ON, Canada) | Vevo 2100 or 3100 | |
Isoflurane | Akorn Animal Health, Inc. | NDC: 59399-106-01 | |
LabChart software | ADInstruments | Pro version 8.1.5 | |
Poloxamer 407 | Sigma-Aldrich | 16758 | |
PV catheter | Millar Instrument | PVR 1035 | |
Ultrasound analysis software | Vevo Lab | ||
Wild-type (WT) mice on 129J background | Jackson Laboratory |