Canlı Hücrelerde Hiperozmotik Strese Yanıt Olarak İntrinsik Olarak Düzensiz Bölgelerin Yapısal Duyarlılığının FRET Kullanılarak Tahmini
Summary
Doğası gereği düzensiz bölgeler (IDR’ler), çevresel değişikliklere yanıt olarak konformasyonlarını değiştiren esnek protein alanlarıdır. Topluluk floresan rezonans enerji transferi (FRET), farklı koşullar altında protein boyutlarını tahmin edebilir. Hiperozmotik stres altında yaşayan Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR yapısal duyarlılığını değerlendirmek için bir FRET yaklaşımı sunuyoruz.
Abstract
Kendinden düzensiz bölgeler (IDR’ler), önemli hücresel süreçlere katılan protein alanlarıdır. Stres koşulları sırasında, hücresel ortamın fizikokimyasal özellikleri değişir ve IDR’lerin konformasyonel topluluğunu doğrudan etkiler. IDR’ler doğası gereği çevresel bozulmalara karşı hassastır. Hücrenin fizikokimyasal özelliklerinin IDR’lerin konformasyonel topluluğunu nasıl düzenlediğini incelemek, işlevlerinin çevresel kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada, hiperozmotik stres koşullarına yanıt olarak canlı Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde IDR’lerin yapısal duyarlılığını ölçmek için adım adım bir yöntem açıklıyoruz. Herhangi bir ozmolit içeren hücrelere uygulanan hiperozmotik stresin aşamalı bir artışı sırasında IDR’lerin küresel boyutlarının nasıl değiştiğini tahmin etmek için topluluk floresan rezonans enerji transferinin (FRET) kullanımını sunuyoruz. Ek olarak, floresan ölçümlerini işlemek ve farklı IDR’ler için yapısal hassasiyeti karşılaştırmak için bir komut dosyası sağlıyoruz. Araştırmacılar bu yöntemi izleyerek, IDR’lerin değişen ortamlar üzerine karmaşık hücre içi ortamda geçirdikleri konformasyonel değişiklikler hakkında değerli bilgiler edinebilirler.
Introduction
Kendinden düzensiz bölgeler (IDR’ler) hücresel süreçlerde kritik bileşenlerdir1. Yapılandırılmış alanlarla kombinasyon halinde, IDR’ler protein fonksiyonları için gereklidir. IDR’lerin amino asit bileşimi önyargılıdır ve esas olarak yüklü, hidrofilik ve küçük kalıntılarla temsil edilir. Bu özellik nedeniyle, IDR’ler düşük karmaşıklık alanları 2,3 olarak kabul edilir. Çok sayıda IDR, öncelikle bu bölgelerin patolojik durumlarda, özellikle nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli bir rol oynaması nedeniyle dikkat çekmiştir. Bu tür hastalıklar, nöronlarda IDR’lerin kendi kendine toplanması ve ardından hücre dışı veya hücre içi birikmesi ile karakterize edilir4. Bu tür IDR’lerin örnekleri arasında Alzheimer hastalığında amiloid-β (Aβ), Huntington hastalığında huntingtin (HTT) ve amyotrofik lateral skleroz ve frontotemporal demansta sarkomda (FUS) kaynaşmış TAR DNA bağlayıcı protein-43 (TDP-43)bulunur 4. Hastalık bağlamında IDR’lerin yapısal yeniden düzenlemelerinin incelenmesi, floresan rezonans enerji transferi (FRET) dahil olmak üzere spektroskopik yöntemlerle önemli ölçüde geliştirilmiştir.
IDR’lerin hidrofilik ve genişletilmiş doğası, onları çözelti ortamının fizikokimyasal özelliklerindeki değişikliklere karşı son derece hassas hale getirir5. IDR’lerin konformasyonel topluluğunun çevre tarafından değiştirilme derecesine yapısal duyarlılık 5,6,7 denir. IDR’lerin konformasyonunu ve dinamiklerini incelemek için dairesel dikroizm (CD) ve küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS)8,9 dahil olmak üzere farklı teknikler kullanılabilir. Ne yazık ki, CD ve SAXS büyük miktarlarda saflaştırılmış protein gerektirir, bu nedenle hücrelerdeki çalışmalar için uygun değildirler. Buna karşılık, FRET, bir IDR’yi spesifik olarak etiketleyen iki floresan molekülünün floresan yoğunluğunu ölçen bir tekniktir, yani canlı hücreler10 gibi karmaşık karışımlarda izlenebilirler. Canlı hücrelerdeki IDR’lerin yapısal duyarlılığının dinamik olarak ölçülmesi, çevrenin düzensiz proteomun konformasyonunu ve işlevini nasıl düzenlediğini anlamak için gereklidir.
FRET, IDR’lerin yapısal duyarlılığının yanı sıra canlı hücrelerdeki küresel ve çok alanlı proteinlerin ölçülmesi için güçlü bir yöntemdir. Yöntem, FRET çifti olarak bilinen iki floresan protein (FP) arasına sıkıştırılmış bir IDR’den oluşan bir yapı gerektirir. Bu protokol için, IDR’lerin duyarlılığı6 ile ilgili önceki bir çalışmada bildirilen diğer FP’lere kıyasla, geniş dinamik aralıkları nedeniyle donör FP olarak mCerulean3 ve alıcı FP olarak Sitrin kullanılmasını öneriyoruz. FRET daha önce farklı hücresel bağlamlarda bir bitki IDR’sinin yapısal hassasiyetini ölçmek için kullanılmıştır6. Ek olarak, bu teknik, hem in vitro hem de in vivo olarak farklı araştırma grupları tarafından IDR’lerin genel protein boyutlarını karakterize etmek için kullanılmıştır 5,11.
Burada, canlı maya (Saccharomyces cerevisiae) hücrelerinde IDR’lerin yapısal duyarlılığını incelemek için topluluk FRET yöntemini açıklıyoruz. AtLEA4-5 adlı bir tesis IDR’sine dayanan temsili sonuçları gösteriyoruz. AtLEA4-5 çözelti içinde düzensizdir, ancak makromoleküler kalabalıklaşma indüklendiğinde α-sarmal halinde katlanır in vitro12. AtLEA4-5, bu yöntem için iyi bir referans modeldir, çünkü nispeten küçüktür (158 kalıntı), düzensiz ve in silico ve in vitro 6,12 bildirildiği gibi çevresel bozulmaya duyarlıdır. Burada sunulan yöntem, maya hücrelerinin büyümesi kolay olduğu ve tedavinin küçük hacimlerde uygulandığı için yüksek verimli yaklaşımlar için ölçeklendirilebilir. Ek olarak, protokolde yapılan küçük değişiklikler, bakteri ve bitki hücreleri gibi diğer hücresel sistemlere de uygulanabilir6. Protokol, çoğu araştırma kurumunda bulunan bir ekipman olan floresan modlu bir mikroplaka okuyucuya erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntem, IDR’ler topluluğunun küresel boyutlarının çevresel bozulmaları nasıl algıladığına ve bunlara nasıl tepki verdiğine dair içgörüler elde etmenin bir yolunu sunar. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış bir yapıya dayanır ve maya hücrelerinde plazmit stabil ekspresyonunun ötesinde hiçbir ek bileşen gerektirmez, bu da onu diğer hücre tiplerindeki potansiyel uygulamalar için uyarlanabilir hale getirir. Ayrıca, ökaryotik hücrelerin yaşam döngüleri boyunca yaşadıkları di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Makalenin eleştirel incelemesi için Cuevas-Velazquez laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) proje numarası IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), proje numarası 252952; ve Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Grant 5000-9182. CET (CVU 1083636) ve CAPD (CVU 1269643), M.Sc. Bursları için CONAHCYT’e teşekkür eder.
Materials
| 96-well plate | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| BglII | New England BioLabs | R0144S | |
| BJ5465 cells | American Type Culture Collection | 208289 | |
| Buffer MES 50 mM | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Buffer Tris-HCl 10 mM | Invitrogen | 15506017 | |
| EDTA 1 mM | Merck | 108452 | |
| Falcon tubes | Corning | 352057 | |
| LB media | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Lithium acetate 0.1 M | Sigma-Aldrich | L6883 | |
| Low Melt Agarose | GOLDBIO | A-204-25 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | 5452000010 | |
| Miniprep kit | ZymoPure | D4210 | |
| NaOH 0.02 M | Merck | 106462 | |
| PEG 3,350 40% | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 | addgene | 178189 | |
| Plate reader | BMG LABTECH | CLARIOstar Plus | |
| SacI | New England BioLabs | R3156S | |
| Salmon sperm DNA 2 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15632011 | |
| SD-Ura | Sigma-Aldrich | Y1501 | |
| Sodium cloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Taq polymesare | Promega | M5123 | |
| Transiluminator | Accuris instruments | E4000 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate3 | |
| YPD media | Sigma-Aldrich | Y1500 |
Riferimenti
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (1), 18-29 (2015).
- Covarrubias, A. A., Romero-Pérez, P. S., Cuevas-Velazquez, C. L., Rendón-Luna, D. F. The functional diversity of structural disorder in plant proteins. Arch Biochem Biophys. 680, 108229 (2019).
- Ahmed, S. S., et al. Characterization of intrinsically disordered regions in proteins informed by human genetic diversity. PLoS Comput Biol. 18 (3), e1009911 (2022).
- Birol, M., Melo, A. M. Untangling the conformational polymorphism of disordered proteins associated with neurodegeneration at the single-molecule level. Front Mol Neurosci. 12, 309 (2019).
- Moses, D., et al. Revealing the hidden sensitivity of intrinsically disordered proteins to their chemical environment. J Phys Chem Lett. 11 (23), 10131-10136 (2020).
- Cuevas-Velazquez, C. L., et al. Intrinsically disordered protein biosensor tracks the physical-chemical effects of osmotic stress on cells. Nat Commun. 12 (1), 5438 (2021).
- Holehouse, A. S., Sukenik, S. Controlling structural bias in intrinsically disordered proteins using solution space scanning. J Chem Theory Comput. 16 (3), 1794-1805 (2020).
- Martin, E. W., Hopkins, J. B., Mittag, T. Small-angle X-ray scattering experiments of monodisperse intrinsically disordered protein samples close to the solubility limit. Methods Enzymol. 646, 185-222 (2021).
- Miles, A. J., Drew, E. D., Wallace, B. A. DichroIDP: a method for analyses of intrinsically disordered proteins using circular dichroism spectroscopy. Commun Biol. 6 (1), 823 (2023).
- Kaminski, C. F., Rees, E. J., Schierle, G. S. K. A quantitative protocol for intensity-based live cell FRET imaging. Method Mol Biol. 1076, 445-454 (2014).
- Moses, D., et al. Structural biases in disordered proteins are prevalent in the cell. bioRxiv. , (2022).
- Cuevas-Velazquez, C. L., Saab-Rincón, G., Reyes, J. L., Covarrubias, A. A. The Unstructured N-terminal Region of Arabidopsis Group 4 Late Embryogenesis Abundant (LEA) Proteins Is Required for Folding and for Chaperone-like Activity under Water Deficit. J Biol Chem. 291 (20), 10893-10903 (2016).
- JoVE Science Education Database. . Restriction enzyme digests. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Gel purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA ligation reactions. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Bacterial transformation using heat Ssock and competent cells. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . PCR: Principle, instrumentation, and applications. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . Plasmid purification. , (2023).
- JoVE Science Education Database. . DNA gel electrophoresis. , (2023).
- JoVE Core Molecular Biology. Sanger/chain termination sequencing using dideoxynucleotides – Concept Available from: https://app.jove.com/science-education/v/12020/sanger-sequencing (2023)
- Theillet, F. X., et al. Physicochemical properties of cells and their effects on intrinsically disordered proteins (IDPs). Chem Rev. 114 (13), 6661-6714 (2014).
- Brutscher, B., et al. NMR methods for the study of instrinsically disordered proteins structure, dynamics, and interactions: General overview and practical guidelines. Adv Exp Med Biol. 870, 49-122 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annu Rev Phys Chem. 71, 391-414 (2020).
- Roebroek, T., et al. Simultaneous readout of multiple FRET pairs using photochromism. Nat Commun. 12 (1), 2005 (2021).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nat Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
- Belott, C., Janis, B., Menze, M. A. Liquid-liquid phase separation promotes animal desiccation tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (44), 27676-27684 (2020).
- Miermont, A., et al. Severe osmotic compression triggers a slowdown of intracellular signaling, which can be explained by molecular crowding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (14), 5725-5730 (2013).
- Saito, H., Posas, F. Response to hyperosmotic stress. Genetica. 192 (2), 289-318 (2012).
- Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
- Cattani, J., Subramaniam, V., Drescher, M. Room-temperature in-cell EPR spectroscopy: alpha-Synuclein disease variants remain intrinsically disordered in the cell. Phys Chem Chem Phys. 19 (28), 18147-18151 (2017).
- Beveridge, R., Chappuis, Q., Macphee, C., Barran, P. Mass spectrometry methods for intrinsically disordered proteins. Analyst. 138 (1), 32-42 (2013).
- Beveridge, R., et al. Ion mobility mass spectrometry uncovers the impact of the patterning of oppositely charged residues on the conformational distributions of intrinsically disordered proteins. J Am Chem Soc. 141 (12), 4908-4918 (2019).
