使用 FRET估计活细胞中响应高渗应激的固有无序区域的结构敏感性

固有无序区域 （IDR） 是细胞过程中的关键组成部分¹。IDR与结构结构域相结合，对蛋白质功能至关重要。IDRs的氨基酸组成是有偏差的，主要由带电的、亲水的和小残基表示。由于这一特性，IDR 被认为是低复杂度域 ^2,3。许多IDR引起了人们的关注，主要是因为这些区域在病理状况中起着至关重要的作用，尤其是神经退行性疾病。此类疾病的特征是神经元中 IDR 的自组装和随后的细胞外或细胞内沉积⁴。此类 IDR 的例子包括阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白 β （Aβ）、亨廷顿病中的亨廷顿蛋白 （HTT） 以及肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆的 TAR DNA 结合蛋白-43 和肉瘤融合蛋白 （FUS）⁴。包括荧光共振能量转移 （FRET） 在内的光谱方法显着增强了对疾病背景下 IDR 结构重排的研究。

IDR的亲水性和扩展性使其对溶液环境的理化性质变化极为敏感⁵。IDR的构象集合被环境改变的程度称为结构敏感性^5,6,7。可以使用不同的技术来研究IDR的构象和动力学，包括圆二色性（CD）和小角X射线散射（SAXS）^8,9。不幸的是，CD和SAXS需要大量的纯化蛋白质，因此它们不适合在细胞中进行研究。相比之下，FRET是一种测量两个荧光分子的荧光强度的技术，这些荧光分子特异性标记一个IDR，这意味着它们可以在复杂的混合物（如活细胞¹⁰）中进行监测。动态测量活细胞中IDR的结构敏感性对于了解环境如何调节无序蛋白质组的构象和功能是必要的。

FRET是一种强大的方法，用于量化活细胞中IDR以及球状和多结构域蛋白的结构敏感性。该方法需要一种由夹在两种荧光蛋白 （FP） 之间的目标 IDR 组成的构建体，称为 FRET对。对于该方案，我们建议使用 mCerulean3 作为供体 FP 和 Citrine 作为受体 FP，因为它们的动态范围很大，与之前关于 IDR 灵敏度⁶ 的研究中报告的其他 FP 相比。FRET以前已被用于测量植物IDR在不同细胞环境中的结构敏感性⁶。此外，该技术已被不同的研究小组用于表征 IDR 的整体蛋白质尺寸 体外和体内 ^5,11。

在这里，我们描述了用于研究活酵母（酿酒酵母）细胞中IDR结构敏感性的集成FRET方法。我们展示了基于名为AtLEA4-5的植物IDR的代表性结果。AtLEA4-5 在溶液中是无序的，但在体外诱导大分子拥挤时折叠成α螺旋 ¹²。AtLEA4-5 是该方法的良好参考模型，因为它相对较小（158 个残基）、无序且对环境扰动敏感，如计算机和体外^{报道的那样 6,12}。这里介绍的方法可以针对高通量方法进行扩展，因为酵母细胞易于生长，并且处理量小。此外，对方案的微小修改可以应用于其他细胞系统，例如细菌和植物细胞⁶。该协议可以在任何分子生物学实验室中进行，可以使用具有荧光模式的酶标仪，这是大多数研究机构提供的设备。