Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro

REMARQUE : Le protocole suivant a été conçu pour pouvoir être utilisé conjointement avec un dosage de la protéine de l’acide bicinchoninique (BCA) et un dosage de l’adénylate kinase (AK) pour normaliser les échantillons aux traitements. Assurez-vous que l’opérateur porte une tenue appropriée et l’équipement de sécurité nécessaire, comme une blouse de laboratoire Howie, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité de classe I, tout au long de la préparation et de l’utilisation des matériaux. Le protocole est divisé en plusieurs étapes. 1. Préparation des stocks et des solutions de travail Préparer des solutions mères d’étalon de 100 mM de GSH dans 1 mM de HCl (préparées à partir de 37 % de HCl dans de l’eau doublement distillée (ddH2O)).REMARQUE : En cas de dilution à partir d’un acide hautement concentré, tel que 37% HCl, assurez-vous du processus correct d’ajout d’acide à l’eau dans une hotte de classe I. Préparer un stock de 22,35 mM d’OPA en éthanol absolu. Effectuez cette étape dans une hotte de classe I. Préparez 25 mM de N-éthylmaléimide (NEM) dans du ddH2O. Effectuez cette étape dans une hotte de classe I.REMARQUE : Ces trois solutions peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 3 mois. Préparer 0,01 M de tris(2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE) jusqu’à un volume total de 500 μL, nécessaire pour 100 puits. Préparer 100 μL d’étalon de 1 mM de GSH, dilué à partir d’un échantillon de 100 mM à l’aide de jdH2O. Utiliser soit un tampon de lyse par immunoprécipitation (IP), soit la formulation suivante : 394 mg de Tris-HCl (concentration finale de 25 mM), 877 mg de NaCl (concentration finale de 150 mM), 29 mg d’EDTA (concentration finale de 1 mM), soit 1 mL de NP-40 à 100 % ou d’IGEPAL CA-630 (concentration finale de 1 % V/V), 5 mL de glycérol (concentration finale de 5 % V/V), 84 mL de ddH2O. Mélanger les composants en agitant doucement et ajuster le pH à 7,4. Transvaser dans une fiole jaugée de 100 mL et ajouter le volume restant de ddH2O pour atteindre un volume final de 100 mL. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à une température de 2 à 8 °C jusqu’à 6 mois.REMARQUE : Les solutions de lyse agissent comme un contaminant/interférent dans cet essai ; Par conséquent, les formulations ci-dessus sont spécifiées. Préparez 1 L de solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M complétée par de l’acide éthylènediamine tétraacétique (PBS-EDTA) à 3 valeurs de pH différentes, à savoir 7,2, 8,5 et 9,0. Utiliser un tampon PBS commercial de 0,1 M complété par 1 mM d’EDTA (292,24 mg/L) ou la formulation 10x (1 L) suivante : 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na2HPO4, 2,4 g de KH2PO4, 800 mL de ddH2O. Ajouter et mélanger ; Complétez jusqu’à 1 L. Autoclavez la solution pour la stérilité et conservez-la pendant 12 mois à température ambiante. À partir de la solution mère 10x, préparez une solution de travail de PBS et complétez-la avec de l’EDTA (concentration comme indiqué précédemment).REMARQUE : Le pH est d’une importance cruciale ; assurez-vous que le pH est précis avant de commencer le protocole. Effectuer une dilution en série 1:2 de 1 mM de GSH à l’aide de ddH2O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM et 7,8125 μM). Ajouter 10 μL de chaque concentration dans les puits étalons (effectué en double). Les échantillons seront dilués dans un tampon de lyse ; par conséquent, les concentrations seront de 1/5e de leur concentration initiale par la suite (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM).REMARQUE : Les concentrations finales pour l’étalonnage seront de 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm et 234,4 nm. 2. Préparation du dosage REMARQUE : Ce protocole utilise des lignées cellulaires humaines HepG2, A549 et J774, qui ont été achetées commercialement auprès de l’ATCC. Ces lignées cellulaires ont été utilisées conformément aux lignes directrices approuvées décrites dans les lois et règlements sur la culture animale et tissulaire de l’Université. 24 h avant le début de l’essai, les cellules de semence aux concentrations indiquées au tableau 1 ; Cependant, en fonction de la lignée cellulaire/du type de cellule et du traitement utilisé, ajustez la densité au besoin. Cultivez des cellules dans un milieu de croissance complet (milieu essentiel modifié Eagles (EMEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (HIFS), 1 % de Penstrep (10 000 U/mL de pénicilline/10 mg/mL de streptomycine) et 1 % d’acides aminés non essentiels. Cellules d’ensemencement à l’aide de méthodes d’ensemencement cellulaire conventionnelles32. Cellules germées dans des plaques entièrement noires si elles n’utilisent pas la microscopie post-essai. Évaluer la confluence et l’état général des cellules dans le ballon T75 avant de les utiliser par microscopie. Dans une enceinte de sécurité biologique propre et stérile de classe II et en suivant une technique d’asepsie stricte, jeter les milieux cellulaires, laver délicatement les cellules avec ~15 mL de PBS stérile à température ambiante (RT) et jeter. Dans la fiole cellulaire, ajouter 5 mL de trypsine 1x stérile, secouer doucement pour assurer la couverture de la monocouche cellulaire et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 minutes pour faciliter le détachement des cellules. Arrêter la trypsinisation par l’ajout d’un milieu de croissance contenant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (10 %), environ 10 mL. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL et granuler à 200 x g pendant 5 min. Jetez le support et remplacez-le par 5 mL du même support. Remettre les cellules en suspension dans le tube jusqu’à ce qu’elles soient homogènes et qu’il n’y ait plus d’agglutination. Retirer 20 μL de suspension cellulaire et les placer dans un hémocytomètre pour le comptage. Une fois que le nombre de cellules nécessaires a été calculé, effectuez une dilution pour obtenir une solution avec la bonne densité cellulaire. Supports de pipette contenant des cellules en plaques de 96 puits (capacité de 350 μL), avec un volume maximal de 200 μL par puits. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h pour qu’elles adhèrent à la surface de la plaque. Pour évaluer à la fois le glutathion total et le GSSG, traitez des échantillons pour les deux affections. Ensemencer et traiter 6 puits pour fournir 2 ensembles de GSH et de GSSG avec 3 répétitions techniques (la figure 1 montre la disposition). S’assurer que tous les réactifs sont préparés de manière appropriée avant le début de l’essai ; s’assurer que tous les composants et réactifs du tampon sont à la RT avant de commencer la construction des tampons ou l’utilisation dans l’essai, à l’exception du PBS à pH 7,4 (sans EDTA), qui doit être conservé sur de la glace ou réfrigéré jusqu’à l’utilisation.REMARQUE : Il est d’une importance cruciale que la formation de bulles soit limitée au minimum pour permettre aux réactions souhaitées de se produire dans le test et permettre une quantification précise via le lecteur de plaques. Lignée cellulaire Densité de semis (plaque de 96 puits) HepG2 10 000 cellules / puits A549 5 000 cellules / puits J774 10 000 cellules / puits Tableau 1 : Densités d’ensemencement suggérées pour les lignées cellulaires choisies. Des densités d’ensemencement différentes ont été démontrées pour trois lignées cellulaires différentes utilisées dans les données représentées, à savoir A549, J774 et HepG2. Figure 1 : Schéma proposé pour l’ensemencement de 96 plaques de puits pour la détermination simultanée du glutathion total et du disulfure de glutathion. Des puits pour l’étalonnage et les contrôles sont également présentés. Les puits qui ne sont pas utilisés sont représentés par une croix. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 3. Traitement des nanomatériaux Pesez les nanomatériaux (en particulier le ZnO, le TiO2, le CuO et l’Ag) dans une balance capable de μg. Effectuer un calcul pour atteindre une concentration initiale de 1 mg/mL par nanomatériau. Transférer des solutions de nanomatériaux dans un sonicateur et du sonicate pendant 16 min à l’aide d’un bain de sonication (38 W) pour produire une solution homogène. Effectuer une série de dilutions pour chaque nanomatériau à 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL. Retirez les cellules de l’incubateur et lavez-les légèrement avec RT PBS. Après s’être assuré que tout le PBS a été éliminé, ajouter 100 μL de traitements dans la plaque, avec des témoins (milieux de culture sans HIFS). Après l’application du traitement sur les cellules, incuber avec les nanomatériaux dans un incubateur à 37°C (5% de CO2) pendant 4 h ; ensuite, utilisez le protocole ci-dessous pour quantifier le GSH : GSSG, concentration en protéines et libération d’AK. 4. Protocole d’analyse Après l’exposition au traitement (Figure 2A), évaluer la viabilité par l’activité de l’adénylate kinase (AK) (facultatif). Utilisez un kit commercial pour ce test en suivant les instructions du fabricant. Tourner les plaques dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min pour granuler légèrement le traitement et les débris cellulaires (figure 2B). Retirer doucement 20 μL de surnageant de milieu de chaque échantillon et puits témoin (comme indiqué ci-dessus) et pipeter dans une plaque blanche adjacente à 96 puits dans le même format de disposition (figure 2C). Ajoutez 100 μL de solution de travail du kit AK dans chaque puits, protégez la plaque de la lumière et laissez agir pendant 10 min à température ambiante. Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques à 1000 comptes/s. Pour les étalons de GSH, ajouter 40 μL de tampon de glutathion total dans chaque puits (figure 2D ; facultatif, requis pour la quantification). Aspirer le reste du milieu de la plaque et laver 3 fois avec du PBS 0,1 M glacé, pH 7,2, en jetant chaque lavage (figure 2E) à l’exception des étalons. Laissez le lavage final dans la plaque jusqu’à ce que l’étalonnage GSH ait été chargé dans la plaque. Ajouter 10 μL de chaque concentration de glutathion et blanc (ddH2O) dans les puits en trois exemplaires. Retirer le lavage final du PBS et ajouter les mélanges dans chaque puits conformément au tableau 2 pour la quantification cible souhaitée (figure 2E). Calculez les volumes requis avant de commencer cette étape en raison d’une perte d’activité urgente avec des tampons complets. Assurez-vous que ces mélanges de réactifs sont préparés avant de commencer le processus de test, mais ne les laissez pas reposer plus de 30 minutes avant de les utiliser. Placez-le sur un agitateur de plaque orbitale et laissez la plaque trembler à 300 tr/min pendant 2 min (Figure 2F). Retirer de l’agitateur et ajouter 5 μL de solution de PTCE 0,01 M dans chaque puits, à l’exclusion du puits de contrôle NEM. Remettez la plaque dans l’agitateur et laissez incuber pendant 10 min (Figure 2F). Transférer la plaque dans la centrifugeuse et tourner à 200 x g pendant 5 min. Transférer 25 μL de chaque puits d’échantillon dans une autre plaque de 96 puits (transparente) ; Celui-ci sera utilisé pour la concentration en protéines (voir étape 4.15 ; Figure 2G). Ne transférez pas d’étalons ou de contrôles d’essai. S’assurer que le volume final de chaque puits est de 30 μL ; retirer le volume des contrôles et des normes pour répondre à cette exigence (figure 2H). Ajouter 170 μL de solution d’OPA fonctionnelle dans chaque puits, protéger la plaque de la lumière et placer sur un agitateur pendant 15 minutes (figure 2I). Lire la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques à Ex340/Em450 (Figure 2J). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles pendant l’étape de mesure ; Ils auront un impact néfaste à la fois sur la réaction et sur la quantification via le lecteur de plaques. Pour quantifier la teneur en protéines des cellules lysées, utilisez un kit de dosage BCA commercial. Transférez les échantillons prélevés à l’étape 4.12 sur une nouvelle plaque de 96 puits (transparente) à 25 μL par puits. Utiliser un étalon d’albumine sérique bovine (BSA) dilué dans un tampon de lyse IP et l’ajouter à la plaque en trois exemplaires à raison de 25 μL par puits. Les concentrations exactes sont définies dans le protocole du kit BCA. Préparez une solution de travail composée d’un rapport de 50:1 des réactifs A et B de la trousse BCA et ajoutez 200 μL à chaque puits contenant l’échantillon, l’étalon et le témoin. Protégez les plaques de la lumière et incubez à 37 °C pendant 30 min (Figure 2K). Retirer les échantillons de l’incubateur, laisser équilibrer à température ambiante pendant 5 min, puis lire l’absorbance via un lecteur de plaque à 562 nm (Figure 2L). Concentration totale de glutathion mélange de réactifs de lyse Composant Volume Tampon de lyse 50μL Volume total / puits 50μL Mélange de réactifs de lyse de concentration de glutathion oxydé Composant Volume Tampon de lyse 49,5 μL NEM (25 mM) 0,5 μL Volume total / puits 50μL UTILISEZ LES DEUX SOLUTIONS DANS LES 30 MINUTES SUIVANT LA COMPOSITION DU MÉLANGE Composant de la solution de détection OPA Volume OPA 3mg/mL 5μL PBS (pH 9,0) 165μL Volume total / puits 170μL Tableau 2 : Volumes de réactifs nécessaires à l’exécution du protocole. Volumes requis par puits pour la détermination du glutathion total, du disulfure de glutathion et du réactif de travail. Assurez-vous que les volumes requis sont calculés et qu’un excédent est inclus pour tenir compte de la perte de volume par transfert. Figure 2 : Représentation schématique du protocole. (A) Ensemencement initial, incubation et traitement des cellules. (B) Centrifugation pour séparer les fluides des solides en suspension. (C) Transfert de milieu pour le dosage de l’adénylate kinase. (D) Ajout des concentrations de glutathion pour la plage d’étalonnage. (E) Étapes de lavage et ajout de réactifs de lyse. (F) Ajout de tampon et ajout de tris(2-carboxyéthyl) phosphine avec étape d’agitation. (G) Centrifugation de cellules lysées pour l’élimination des milieux pour l’analyse des protéines. (H) Retrait du support pour égaliser le volume sur la plaque. (I) Addition d’une solution de travail d’ortho-phtalaldéhyde avec incubation par agitation. (J) Mesure de la fluorescence de l’ortho-phtalaldéhyde par lecteur de plaques. (K) Étapes d’incubation pour le dosage de l’acide bicinchoninique pour la détermination des protéines. (L) Mesure de la concentration protéique, permettant la normalisation des valeurs de glutathion : disulfure de glutathion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.