JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

In vivo beeldvorming van leversferoïden geënt in de voorste oogkamer van het muizenoog

Published: March 29, 2024
doi:
10.3791/66234
, , , , ,
1The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet,Karolinska University Hospital, 2Tecnológico de Monterrey, 3Diabetes Research Institute, Miller School of Medicine,University of Miami

Summary

Hier beschrijven we een platform dat niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk maakt van leversferoïden die zijn geënt in de voorste oogkamer van het oog van de muis. De workflow strekt zich uit van het genereren van sferoïden van primaire levercellen tot transplantatie in het oog van de muis en in vivo beeldvorming met cellulaire resolutie door confocale microscopie.

Abstract

Biomedische studies van de lever bij zoogdieren worden gehinderd door het gebrek aan methoden voor in vivo niet-invasieve longitudinale beeldvorming met cellulaire resolutie. Tot nu toe is optische beeldvorming van de lever in situ mogelijk door middel van intravitale beeldvorming, die beeldvorming met hoge resolutie op cellulair niveau biedt, maar niet meerdere keren en dus longitudinaal bij hetzelfde dier kan worden uitgevoerd. Niet-invasieve beeldvormingsmethoden, zoals bioluminescentie, maken herhaalde beeldvormingssessies op hetzelfde dier mogelijk, maar bereiken geen celresolutie. Om deze lacune in de methodologie aan te pakken, hebben we een platform ontwikkeld voor niet-invasieve in vivo beeldvorming van leversferoïden die zijn geënt in de voorste oogkamer van het oog van de muis. In de workflow die in deze studie wordt beschreven, worden primaire leversferoïden van muizen in vitro gegenereerd en getransplanteerd in de voorste oogkamer van ontvangende muizen, waar ze op de iris worden geënt. Het hoornvlies fungeert als een natuurlijk lichaamsvenster waardoor we de geënte sferoïden kunnen afbeelden met conventionele confocale microscopie. De sferoïden overleven maandenlang in het oog, waarbij de cellen kunnen worden bestudeerd in een context van gezondheid en ziekte, en kunnen worden gecontroleerd als reactie op verschillende stimuli tijdens herhaalde beeldvormingssessies met behulp van geschikte fluorescerende sondes. In dit protocol geven we een overzicht van de noodzakelijke stappen om dit beeldvormingssysteem te implementeren en leggen we uit hoe het potentieel ervan het beste kan worden benut.

Introduction

De monitoring van de leverfunctie bij zoogdieren tijdens gezondheid en ziekte wordt beperkt door het ontbreken van niet-invasieve in vivo beeldvormingstechnieken met hoge resolutie. De visualisatie van dit orgaan wordt belemmerd door de ontoegankelijke locatie, en om cellulaire processen samen te voegen, vertrouwen in vivo-studies op het offeren van dieren op verschillende tijdstippen. Om deze beeldvormingsbeperking te omzeilen, vertrouwt veel werk op in vitro modellen, waarin leverachtige microweefsels worden gevisualiseerd en bestudeerd in een gecontroleerde omgeving.

In de afgelopen jaren heeft de ontwikkeling van driedimensionale kweeksystemen, zoals leversferoïden, het leveronderzoek geholpen en bevorderd. Leversferoïden zijn meercellige aggregaten die tot opzekere hoogte de micro-omgeving en complexe cel-celinteracties van leverweefsel nabootsen 1 en duidelijke voordelen bieden ten opzichte van traditionele monolaagculturen 2,3. Leversferoïden worden ook gebruikt als modellen voor verschillende leverziekten 4,5,6 en zijn van groot belang geweest voor het begrijpen van ziektemechanismen. Toch zijn de belangrijkste beperkingen van de huidige in vitro levermodellen het ontbreken van een fysiologisch in vivo milieu en de beperkte gebruikstijd in cultuur (ongeveer 20 dagen)3. Leversferoïden zijn eerder in vivo getransplanteerd naar verschillende plaatsen, zoals onder de niercapsule7 of intraperitoneaal8, die niet toegankelijk zijn voor optische beeldvorming. Intravitale leverbeeldvorming is een state-of-the-art techniek die real-time beeldvorming met celresolutie biedt. Momenteel is deze in situ beeldvorming van de lever alleen mogelijk op het uitwendige orgaan, dat zeer invasief en vaak terminaal is9. Hoewel het plaatsen van een buikvenster herhaalde leverbeeldvormingssessies mogelijk zou maken, brengt het complexe chirurgie en nazorg met zich mee.

Om longitudinale monitoring met cellulaire resolutie uit te voeren, onderzochten we transplantatie van leversferoïden in de voorste oogkamer (ACE) van muizen, waar het leverachtige weefsel wordt geënt in een fysiologisch milieu, verbonden met de lichaamsstimuli en toegankelijk voor optische beeldvorming. Het hoornvlies is een transparant weefsel en fungeert als een venster waardoor microweefsels die op de iris zijn geënt, niet-invasief en longitudinaal kunnen worden afgebeeld door middel van confocale microscopie. Hier presenteren we een workflow van dit nieuw ontwikkelde platform voor in vivo beeldvorming van leversferoïden10. Dit protocol is een stapsgewijze handleiding voor de implementatie ervan, onderverdeeld in (1) de extractie van primaire levercellen van muizen en in vitro vorming van leversferoïden, (2) de transplantatie van leversferoïden in de ACE van ontvangende muizen, en (3) de in vivo beeldvorming van getransplanteerde leversferoïden bij verdoofde muizen. Verder zullen we enkele van de mogelijkheden en toepassingen van dit beeldvormingsplatform laten zien.

Protocol

Alle procedures die op dieren werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van het Karolinska Institutet. 1. Extractie van primaire levercellen van muizen en aanmaak van leversferoïden in vitro VoorbereidingVoor canulatie, leverresectie en isolatie van primaire levercellen bereidt u naast serologische pipetten en centrifugebuisjes (figuur 1A) de volgende steriele materialen of materialen voor eenmalig gebruik: peristaltische pomp, centrifuge met zwenkemmer, absorberend kussen, dissectiemat, twee pincetten met gebogen punt, een chirurgische schaar, een vlindernaald van 27 G, een celzeef van 70 μm, een cellifter, een petrischaaltje van 100 mm, kamer voor het tellen van cellen en microtiterplaten met 96 putjes en U-vormige bodem. Bereid de oplossingen voor die worden gebruikt bij de leverperfusie, de isolatie van primaire levercellen en de aanmaak van leversferoïden zoals vermeld in tabel 1.OPMERKING: De spijsverteringsbuffer en de gradiëntoplossing moeten vers worden bereid. Stel het perfusiesysteem in, bestaande uit een peristaltische pomp, die oplossingen van het waterbad van 42 °C naar de lever leidt (figuur 1A). De hogere temperatuur van het waterbad zorgt ervoor dat de buffers bij de optimale temperatuur van 37 °C de lever bereiken. Pas dit aan afhankelijk van de buislengte en de kamertemperatuur (RT). Plaats voor de canulatie een vlindernaald van 27 G op het uiteinde van de buis. Houd de uitplatingsmedia die in de laatste isolatiestappen worden gebruikt, op 4 °C. ProcedureVerwarm de volgende oplossingen voor in het waterbad van 42 °C in centrifugebuisjes van 50 ml: 40 ml PBS, 20 ml perfusiebuffer en 12 ml digestiebuffer. Om de pompslangen te reinigen en op te warmen, circuleert u ongeveer 20 ml van de voorverwarmde PBS. Vervang de slang naar de perfusiebuffer, vul de slang en vlindernaald en stel het debiet in op 4 ml/min. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slang zitten tijdens het wisselen van buffers gedurende het protocol. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie en gebruik naalden om de ledematen aan de snijplaat te bevestigen. Maak de buikvacht nat met 70% ethanol en ontleed deze om toegang te krijgen tot de spijsverteringsorganen. Beweeg de darmen naar rechts om de poortader en de inferieure vena cava bloot te leggen (Figuur 1B). Draai de vena cava ongeveer halverwege zijn lengte rond met de naald in een horizontale positie, zorg ervoor dat deze stabiel staat en start de pomp. Wanneer de lever begint op te blazen of er witte stippen verschijnen in de nauwere lobben, snijdt u de poortader door zodat het bloed en de perfusiebuffer kunnen wegvloeien. De lever moet onmiddellijk beginnen met blancheren. Moedig het opruimen aan met een gebogen pincet om de poortader met tussenpozen van 5 s vast te klemmen. Herhaal stap 1.2.9 totdat de lever geel is en vrij van bloed (ca. 15-20 ml perfusiebuffer). Stop de slangenpomp om de slang naar de vergistingsbuffer te vervangen en start de pomp opnieuw op. Wanneer de spijsverteringsbuffer de lever bereikt, verlaagt u het debiet tot 2,5 ml/min.OPMERKING: Het fenolrood in de spijsverteringsbuffer maakt het mogelijk om de aankomst in de lever te onderscheiden en maakt het mogelijk om de pompparameters tijdens de behandeling aan te passen. Om ervoor te zorgen dat de buffer alle leverkwabben bereikt en om een goede spijsvertering te garanderen, herhaalt u stap 1.2.9 meerdere keren. Stop de stroom van de peristaltische pomp wanneer de spijsverteringsbuffer uitgeput is of de lever er voldoende verteerd uitziet.OPMERKING: De mate van vertering kan visueel worden gecontroleerd door zachtjes met een tang in de leverlobben te knijpen en te controleren of er kleine vlekken op het weefsel verschijnen. De lever zal ook dun worden. Om de lever te extraheren, snijdt u de leverligamenten en verbindingen in de buikholte door, met als doel deze volledig te verwijderen, en plaatst u deze in de petrischaal met 10 ml koud platingmedium (tabel 1). Maak na het verwijderen van de galblaas kleine kneepjes in de lobben met een pincet, waarbij u het leverkapsel lichtjes scheurt. Door de lever in de schaal te schudden, observeer je cellen die in het medium stromen. Houd de lever stabiel met een tang en sleep de cellifter voorzichtig langs de lobben om de cellen los te maken.OPMERKING: Correcte interlobulaire spijsvertering zal leiden tot celsuspensie in de media, niet in weefselfragmenten. Verzamel met een serologische pipet de celsuspensie uit de petrischaal en filtreer door de celzeef van 70 μm die op een centrifugebuis van 50 ml is geplaatst. Gebruik verse uitplatingsmedia om de schaal met verteerde levercellen te wassen en over te brengen naar het filter. Centrifugeer op 50 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatant, laat ongeveer 1 ml over om de celpellet te bedekken, draai de buis rond om de cellen te resuspenderen en voeg dan geleidelijk 10 ml koud platingmedium toe. Voeg de 10 ml gradiëntoplossing toe aan de celsuspensie en keer de buis voorzichtig 10 keer om. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. De pellet bevat levensvatbare levercellen verrijkt voor hepatocyten, terwijl het supernatans dode cellen en puin bevat. Gooi het supernatans weg met een serologische pipet, laat ongeveer 1 ml over, en resuspendeer de pellet door deze voorzichtig rond te draaien. Voeg 20 ml koudplateermedium toe aan de celsuspensie en centrifugeer 5 minuten bij 4 °C bij 50 x g om de gradiëntoplossing af te wassen. Verwijder het supernatant, laat ongeveer 1 ml boven de pellet en resuspendeer de cellen in 20 ml koud platingmedium.OPMERKING: Hier kan de celkorrel worden verdicht, dus gebruik indien nodig een serologische pipet van 10 ml om de cellen voorzichtig te dissociëren. Bepaal handmatig het aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van een cellentelkamer en Trypan Blue.OPMERKING: De hepatocytcellen zullen snel neerslaan in de buis; Om ze te resuspenderen, keert u de buis een paar keer voorzichtig om. Zaai de levercellen in 200 μL/putje platingmedium bij 1200 cellen/put in 96-wells ultra-lage hechtingsplaten.OPMERKING: Het optimale volume media per put is 200 μL; het is echter mogelijk om cellen te zaaien in 100 μL/putje. Draai de platen 3 minuten op 200 x g om de cellen in het midden van de putjes te verzamelen. Incubeer (37 °C, 5% CO2) de cellen en laat ze gedurende 5 dagen op natuurlijke wijze sferoïden vormen (figuur 1C). Verwijder op dag 5 voorzichtig de helft van het medium in het putje en vervang het door serumvrije onderhoudsmedia (tabel 1). Herhaal deze stap elke 48 uur tot dag 10, wanneer de leversferoïden klaar zijn om te worden getransplanteerd.OPMERKING: De vorming van een capsule-achtige structuur in gekweekte leversferoïden vertoont een goede aggregatie en levensvatbaarheid. 2. Transplantatie van leversferoïden in de voorste oogkamer (ACE) VoorbereidingZorg ervoor dat u voor transplantatie van leversferoïden in de ACE de volgende middelen indeelt (Figuur 2A): stereomicroscoop, isofluraan-anesthesie-eenheid, inductiekamer, isofluraan, verwarmingskussen, op maat gemaakte metalen basisplaat, muiskophouder en gasmasker, pincet bevestigd aan de massieve kruiskoppeling, Hamilton 500 μL plunjerspuit met schroefdraad, siliconen, polyethyleen en pompslangen, op maat gemaakte stompe glazen canule of 24 G-katheter, ethanol 70%, steriele zoutoplossing, steriele naalden van 23 G, oogzalf (vloeibare paraffine en vaseline in een verhouding van 1:1), wegwerpspuit van 1 ml en celsuspensieschotel 35 mm. Reinig de Hamilton-spuit, slang en canule door 70% ethanol en zoutoplossing te passeren. Vul de Hamilton-spuit, het slangetje en de glazen canule met zoutoplossing en bevestig de Hamilton-spuit horizontaal met tape op de werkbank (Figuur 2A). Gebruik een op maat gemaakte stompe glazen canule.Verleng een capillair van borosilicaatglas met behulp van een tweetraps micropipettrekker tot een binnendiameter van >300 μm om de aspiratie van de sferoïden mogelijk te maken. Schuin de punt af en stomp deze af met een micro-elektrodeschuiner en stel de canulepunt een paar seconden bloot aan een vlam om de randen zachter te maken.NOTITIE: De micro-elektrodeafschuiner bestaat uit een roterende schuursteen die handmatig wordt bediend; Daarom zijn specifieke instellingen niet van toepassing. U kunt ook een canule maken met behulp van het plastic gedeelte van een katheter van 24 G (Figuur 2B). Bereid de anesthesie-isofluraaneenheid voor en verwarm het verwarmingskussen tot 37 °C. Bedek de uiteinden van de pincet die aan de stevige kruisverbinding is bevestigd met een stuk polyethyleen slang om een lus te vormen, die helpt om het oog te stabiliseren. Breng de leversferoïden over van de plaat met 96 putjes in een 35 mm celsuspensieschaal met onderhoudsmedia met behulp van een pipet en een tip van 200 μl. ProcedureVerdoof de muis in de inductiekamer met een dosis van 2,5% isofluraan en 280 ml/min lucht. Wanneer de muis bewusteloos is, verlaagt u de anesthesie tot 1,8% isofluraan en 280 ml/min lucht, sluit u de anesthesieslang aan op de kophouder en brengt u het dier snel over op het verwarmingskussen, waarbij u de neus in de kophouder plaatst. Immobiliseer het hoofd met de schroeven, haal het oog voorzichtig uit de oogkas en zet het vast met de tang en plaats een druppel zoutoplossing op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Gebruik onder de stereoscoop de Hamilton-spuit om de leversferoïden op te zuigen en te verzamelen in de punt van de canule en laat ze horizontaal rusten op een schoon oppervlak.OPMERKING: Het opzuigen van media samen met de leversferoïden helpt voorkomen dat ze aan de wanden van de canule blijven plakken. Prik voorzichtig in het hoornvlies met een naald van 23 G en droog het sijpelende kamerwater af met een tissue. Om de incisie breder te maken, schuift u indien nodig de naald voorzichtig zijwaarts om het hoornvlies door te snijden.OPMERKING: Een steriele naald voor eenmalig gebruik wordt gebruikt om de hoornvliespunctie uit te voeren, dus het hoornvlies wordt niet gedesinfecteerd voorafgaand aan de incisie. Voeg zoutoplossing druppels toe aan het oog om uitdroging te voorkomen. Neem de canule met de leversferoïden en houd deze verticaal zodat de sferoïden naar de punt van de canule kunnen trekken. Steek de canule voorzichtig in het gat en gebruik de Hamilton-spuit met de afschuining naar de pupil gericht om de leversferoïden langzaam in de ACE te duwen (Figuur 2C).OPMERKING: Voordat u de canule verwijdert, wordt aanbevolen een paar seconden te wachten totdat de vloeistofdruk in en buiten het oog is aangepast en te voorkomen dat de sferoïden weer uit het oog ontsnappen. Plaats de leversferoïden van buiten het hoornvlies rond de pupil en weg van de incisie door voorzichtig met de punt van de canule in het hoornvlies te prikken (Figuur 2C). Wacht ~5-10 minuten totdat de leversferoïden zich op de iris hebben genesteld voordat u het oog van de tang loslaat. Breng vaseline oogzalf aan op het geopereerde oog, wat helpt bij het smeren en genezen van het hoornvlies. Ga desgewenst verder met het opereren van het tweede oog volgens dezelfde methode. Voordat u de muis wakker maakt, dient u een pijnstiller toe om postoperatief ongemak te voorkomen, bijvoorbeeld 0,1 mg/kg buprenorfine in steriele zoutoplossing, subcutaan toegediend.OPMERKING: Slechts één dosis analgetica werd aan de muizen toegediend omdat ze snel herstelden van deze kleine procedure en geen tekenen van pijn of veranderd gedrag vertoonden. Aangezien deze procedure zeer snel is (minder dan 10 minuten) en slechts licht ongemak veroorzaakt, hebben de muizen geen postoperatieve zorg nodig, behalve de postoperatieve analgesie die wordt toegediend voordat het dier wordt gewekt. 3. In vivo beeldvorming van getransplanteerde leversferoïden in de ACE VoorbereidingBereid de volgende materialen en instrumenten voor voor niet-invasieve in vivo beeldvorming van leversferoïden geënt in ACE (Figuur 3A): rechtopstaande confocale microscoop, objectiefvermogen voor het onderdompelen in water op lange afstand, isofluraan-anesthesie-eenheid, inductiekamer, isofluraan, verwarmingskussen, op maat gemaakte metalen basisplaat, muiskophouder en gasmasker, pincet bevestigd aan het vaste kruisgewricht, kunstmatige traangel, oogzalf (vloeibare paraffine en vaseline in een verhouding van 1:1). Optionele materialen zijn onder meer injecteerbare fluorescentiesondes, wegwerpspuiten en 27 G-naalden voor intraveneuze injectie in de staart. ProcedureVerdoof de muis in de inductiekamer met een dosis van 2,5% isofluraan en 280 ml/min lucht. Wanneer de muis bewusteloos is, verlaagt u de anesthesie tot 1,8% isofluraan en 280 ml/min lucht, sluit u de anesthesieslang aan op de kophouder en brengt u het dier snel over op het verwarmingskussen, waarbij u de neus in de kophouder plaatst. Immobiliseer de kop in de kophouder met behulp van de schroeven. Breng een druppel kunstmatige traangel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen. Injecteer op dit punt intraveneus fluorescerende sondes door de staartader en maak onmiddellijk daarna beeld. Kantel het hoofd, haal het oog voorzichtig uit de oogkas en zet het vast met een tang en in positie onder het objectief. Breng een ruime hoeveelheid kunstmatige traangel aan om de ruimte tussen het hoornvlies en het objectief op te vullen en focus op de leversferoïden door het oculair.OPMERKING: Verwijder indien mogelijk het oculair van een van de oculairs om een niet-vergroot zicht te krijgen en de sferoïden op de iris gemakkelijker te lokaliseren. Om ondanks de ademhalingsbewegingen van het dier een beeld met een hoge resolutie te verkrijgen, gebruikt u 25x objectieven en de volgende beeldinstellingen: formaat 512 x 512 pixels, scansnelheid van 600 Hz en een Z-stackdikte van 3 μm. Zie gedetailleerde beeldvormingsinstellingen in Tabel 2.OPMERKING: Tijdens de beeldvorming wordt de anesthesieconcentratie aangepast van 1,6-2,2 ml/u isofluraan om een oppervlakkig, gecontroleerd ademhalingsritme te bereiken en daardoor de beweging van het dier te minimaliseren. Behandel aan het einde van de beeldvormingssessie de afgebeelde ogen met vaseline oogzalf voordat u isofluraan verwijdert en het dier wakker maakt.

Representative Results

Primaire levercellen, verrijkt voor hepatocyten, werden geïsoleerd uit de lever van muizen door tweestaps collagenaseperfusie, met behulp van een peristaltische pomp om warme buffers door de lever te laten circuleren, gebruikmakend van het vaatstelsel van het orgaan om dissociatie-enzymen aan alle cellen af te leveren (Figuur 1A). Hiervoor werd de inferieure vena cava gecannuleerd en werd de poortader doorgesneden om de doorstroming van buffers mogelijk te maken (Figuur 1B). Eerst werd een op HBSS gebaseerde buffer door de lever gespoeld om het bloed te zuiveren. Als de canulatie succesvol is en er geen bloedstolsels zijn, blancheert de lever en wordt binnen enkele seconden geel. Ten tweede werd een spijsverteringsbuffer met het Libasase-enzymmengsel door de lever gecirculeerd om het weefsel te dissociëren tot een eencellige suspensie. De cellen werden handmatig geteld en gezaaid in 96-well ultra-low-adherence (ULA) platen, die de zelfassemblage tot sferoïden binnen een paar dagen mogelijk maken. Op dag 5 worden de sferoïden gevormd en de dunne capsule die aan de sferoïden grenst, geeft een succesvolle aggregatie aan (Figuur 1C). We wachten tot dag 10 om te transplanteren, waarna de sferoïden compact zijn en sterke cel-celverbindingen hebben ontwikkeld. Het aantal gezaaide cellen per putje bepaalde de grootte van de leversferoïde, met respectievelijk 1000, 1200 en 1500 cellen/putje opleverende sferoïden van 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm en 298 μm ± diameters van 19 μm (gemiddelde ± SD) (figuur 1C,D). Voor transplantatie selecteren we sferoïden met een diameter van ongeveer 250 μm om de volgende redenen: (1) de grootte van de sferoïden mag niet te groot zijn om hypoxie en necrotische kern te voorkomen, maar moet voldoende cellen bevatten om cel-celcommunicatie te ondersteunen en om transplantaatremodellering in het oog mogelijk te maken, (2) het gewicht van sferoïden van deze grootte stelt ze in staat om naar de iris te trekken en hun implantatie te verbeteren, (3) Deze grootte is geschikt voor het transplanteren van 5-10 sferoïden per muizenoog. Voor de transplantatie is een spuit met handmatige schroefdraad nodig die is aangesloten op een glazen canule (Figuur 2A). De glazen canule bestaat uit een capillair van borosilicaatglas dat in eigen huis is gemodificeerd om een fijne stompe punt te hebben met behulp van een micropipettrekker en afschuiner. Een eenvoudigere alternatieve canule kan worden gemaakt met behulp van een in de handel verkrijgbare plastic katheter die is aangesloten op de slang van de spuit en gestabiliseerd is in een pipetpunt (Figuur 2B). De operatie bestaat uit het inoculeren van leversferoïden in de ACE via een incisie in het hoornvlies (figuur 2C). De sferoïden werden aan de randen van de pupil geplaatst om ze beter toegankelijk te maken voor beeldvorming en om te voorkomen dat ze in de ooghoek bewegen. Albinomuizen werden gebruikt voor transplantatie, omdat hun niet-gepigmenteerde iris de in vivo beeldvorming van de getransplanteerde leversferoïden mogelijk maakt. Ontvangende muizen werden in beide ogen getransplanteerd met 7-10 sferoïden/oog, en stereoscopische beelden werden gemaakt 3 dagen na de transplantatie (post-Tx) en 1 week en 1 maand na Tx om de genezing van het hoornvlies en het succes van de sferoïde implantatie te documenteren (Figuur 2D). Merk op dat de verandering in het uiterlijk van de leversferoïden in de ACE tussen vers getransplanteerd en volledig geënt te wijten is aan de vestiging van het transplantaat op de iris, evenals aan de groei van een monolaag van iriscellen over de sferoïde. Het slagingspercentage van de implantatie van leversferoïden in de ACE is 70% (n = 9 ogen bij zowel mannelijke als vrouwelijke muizen) (Figuur 2E). De eerste dagen na Tx zijn het meest cruciaal voor overleving en implantatie, waarschijnlijk omdat het ontvangende dier in zijn ogen wrijft en de sferoïden losmaakt voordat het hoornvlies is genezen. De grootte van de leversferoïden verschilt niet significant post-Tx en vormveranderingen worden toegeschreven aan hermodellering en implantatie van het transplantaat (Figuur 2F). 1 maand na Tx waren alle getransplanteerde sferoïden die op de iris aanwezig waren, gevasculariseerd en geïnnerveerd, zoals blijkt uit immunofluorescentiekleuring (Figuur 2G). Niet-invasieve in vivo beeldvorming wordt uitgevoerd op verdoofde ontvangende muizen met behulp van een rechtopstaande confocale microscoop en een dompelobjectief over lange afstand (Figuur 3A, Tabel 2). De fluorescentiebeeldvorming in de ACE kan op verschillende manieren worden bereikt, zoals weergegeven in figuur 3B. De injectie van fluorescerende sondes in de bloedsomloop van de ontvangende muis maakt de visualisatie van verschillende celtypen en structuren in de sferoïden mogelijk. We gebruikten lectine om bloedvaten te markeren (Figuur 3C), CMFDA om het galcanaliculi-netwerk te observeren (Figuur 3D) en pHrodo-LDL, wat de actieve LDL-opname in sferoïde cellen bevestigde (Figuur 3E). Leversferoïden gegenereerd uit reporter-muismodellen kunnen ook worden gebruikt. Albumine-Cre:tdTomatensferoïden maakten het mogelijk om hepatocyten te labelen en te volgen (Figuur 3F), en sferoïden die de Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) biosensor tot expressie brachten, werden gebruikt om de dynamiek van de celcyclus te visualiseren bij een resolutie van één cel (Figuur 3G). Ten slotte kunnen leversferoïden in vitro genetisch worden gemodificeerd voorafgaand aan transplantatie, en in het geval van adeno-geassocieerd virus (AAV)-GFP-transductie werd de expressie gedurende meer dan 6 maanden in vivo waargenomen (figuur 3H). Figuur 1: Isolatie van primaire hepatocyten van muizen en aanmaak van leversferoïden. (A) Materiaal en apparatuur gebruikt voor de isolatie van primaire hepatocyten van muizen: 1. Isolatiebuffers; 2. Waterbad; 3. Peristaltische pomp; 4. Petrischaal; 5. De zeef van de cel; 6. Absorberend kussen; 7. De mat van de dissectie; 8. Cel Lifter; 9. Vlinder naald 27 G; 10. Ontleed gereedschappen. (B) Buikholte tijdens de operatie: de vena cava wordt gecanuleerd en geperfundeerd, en de poortader wordt doorgesneden om doorstroming van de buffers mogelijk te maken. (C) Helderveldbeelden van de vorming van leversferoïden in vitro 0 (d0), 5 (d5) en 10 (d10) dagen na het zaaien, schaalbalken = 200 μm. (D) Leversferoïde grootte bij verschillende celzaaiconcentraties, n = 21 sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Transplantatie en implantatie van leversferoïden in de ACE van muizen. (A) Materialen en apparatuur die worden gebruikt voor transplantatie (Tx) van leversferoïden in de ACE: 1. Leversferoïden in kweekschaaltje; 2. Steriele zoutoplossing; 3. Oog zalf; 4. naalden 23 g; 5. Canule; 6. Hamilton spuit; 7. De slang van het anesthesiegas; 8. Hoofdhouder en gasmasker; 9. Verwarmingskussen; 10. Op maat gemaakte metalen basisplaat; 11. Pincet en stevige kruiskoppeling. (B) Canule en opstelling van de Hamilton-spuit: 1. Glazen canule aangesloten op de Hamilton-spuit via Portex-slang en een 27G-naald; 2. De glazen canule is verbonden met de Portex-slang via extra segmenten van siliconenslangen en PharMed-slangen; 3. Alternatieve geassembleerde plastic canule; 4. Onderdelen die de plastic canule vormen: 24G BD Insyte plastic katheter verbonden via PharMed-slangen en omhuld met een afgekapte pipetpunt van 10 μl voor stabiliteit en grip. (C) Illustratie van de stappen van de Tx-operatie: 1. De sferoïden worden in de canule verzameld; 2. Het hoornvlies wordt aangeprikt met een naald; 3. De canule wordt in de incisie ingebracht en de sferoïden worden in de ACE losgelaten; 4. Vanaf de buitenkant van het oog worden de sferoïden dicht bij de pupil en weg van de incisie geplaatst. (D) Stereoscopische beelden van leversferoïden (sph) in het oog van de muis op de dag van de operatie en 3-, 7- en 30 dagen na Tx. Pijlen geven levensvatbare sferoïden aan. (E) Leversferoïde (grootte van 1200 cellen/put) implantatiesnelheid post-Tx, n= 9 ogen bij 6 ontvangende muizen. (F) Grootte van leversferoïden in cultuur, voorafgaand aan transplantatie (in vitro, n= 20 sferoïden van enkelvoudig preparaat) en 1 maand post-Tx in de ACE (in vivo, n= 16 sferoïden in 3 ontvangende muizen), berekend door het gemiddelde te nemen van verticale en horizontale diameters. (G) Immunofluorescentiekleuring van getransplanteerde leversferoïden 2 maanden na Tx, met vascularisatie (CD31, roze, stippellijn schetst de sferoïde massa) en sympathische innervatie (tyrosinehydroxylase (TH), oranje), schaalbalk = 100 μm. Gegevens voor paneel F zijn aangepast met toestemming van Lazzeri-Barcelo et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Niet-invasieve intraoculaire in vivo beeldvorming van getransplanteerde leversferoïden. (A) Materiaal en apparatuur gebruikt voor in vivo ACE-beeldvorming: 1. Rechtopstaande confocale laserscanning; 2. Donkere doos; 3. Gemotoriseerde XYZ-fase; 4. Dipping-objectief; 5. Hoofdhouder en gasmasker; 6. Pincet en stevige kruiskoppeling; 7. Verwarmingskussen; 8. Op maat gemaakte metalen basisplaat. (B) Diagram met verschillende benaderingen die worden gebruikt voor in vivo beeldvorming van fluorescerende uitlezingen in leversferoïden die in het oog zijn geënt. (C-H) Representatieve beelden van ACE-leversferoïden tijdens in vivo beeldvorming door confocale microscopie. Het backscatter-signaal wordt gebruikt om het sferoïde volume en de structuur te observeren; (C) Bloedvaten gelabeld door i.v. injectie van fluorescerend lectine, schaalbalk = 100 μm; (D) Gal canaliculi netwerk gelabeld door injectie van fluorescerende CMFDA, schaalbalk = 50 μm; (E) LDL-opname door injectie van fluorescerende pHrodo-LDL-sonde, schaalstaaf = 100 μm; (F) Td-Tomatenexpressie hepatocyten, pijlpunten geven kernen aan en sterretjes geven intrasferoïde vasculatuur aan, schaalbalk = 50 μm; (G) Monitoring van de dynamiek van de celcyclus in leversferoïden die FUCCI tot expressie brengen, schaalbalken = 50 μm (hoofdafbeelding) en 20 μm (blow-up). (H) leversferoïden in vitro getransduceerd met AAV8-GFP voorafgaand aan Tx en afgebeeld in het oog 6 maanden na Tx, schaalbalk = 50 μm. De afbeelding in paneel G is aangepast met toestemming van Lazzeri-Barcelo et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Oplossingen die worden gebruikt voor de isolatie van primaire hepatocyten van muizen. Samenstelling van oplossingen en buffers die nodig zijn voor de isolatie van hepatocyten van muizen. De componenten van de spijsverteringsbuffer en de gradiëntoplossing moeten op de dag van isolatie vers worden gemengd. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2. Confocale Leica SP5 microscoopinstellingen gebruikt voor intraoculaire in vivo beeldvorming van leversferoïden. De tabel is aangepast met toestemming van Lazzeri et al.10. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Dit protocol beschrijft een nieuw platform voor intraoculaire in vivo beeldvorming van leversferoïden die in de ACE zijn geënt. De ACE is eerder gebruikt als transplantatieplaats van andere van organen afgeleide microweefsels, zoals pancreaseilandjes11,12, vanwege de unieke micro-omgeving van implantatie, die rijk is aan bloedvaten, zenuwen en zuurstof, en de toegang tot beeldvorming via het hoornvlies. Hoewel intravitale beeldvorming van de lever de visualisatie van cellen en processen in situ mogelijk maakt, is longitudinale monitoring niet mogelijk. Beeldvorming van de lever door een abdominaal venster brengt een complexe operatie met zich mee, en de beweging van het orgaan in het lichaam maakt het moeilijk om single-cells in de loop van de tijd te volgen. Daarom maakt deze nieuwe beeldvormingsmethode niet-invasieve, longitudinale monitoring van levercellen mogelijk met een resolutie van één cel.

Dit protocol is opgedeeld in drie delen. De eerste is de isolatie van primaire hepatocyten via tweestaps collagenaseperfusie, aangepast van Charni-Natan et al.13, met het verschil dat we de leverperfusie uitvoeren op de dode muis in plaats van op de verdoofde levende dieren. Deze variatie brengt bepaalde voordelen met zich mee, zoals minder ethische overwegingen en het vermijden van anesthesieresten in het organisme. In dit werk genereren we leversferoïden uit de met hepatocyten verrijkte fractie van de isolatie, maar dit sluit niet het potentieel uit om andere niet-parenchymale celpopulaties te isoleren met behulp van andere gespecialiseerde protocollen om cocultuursferoïden van diverse samenstelling te maken14,15.

Het tweede deel van dit protocol omvat de transplantatie van de leversferoïden in de ACE van ontvangende muizen. Dit is een snelle (minder dan 10 minuten) en eenvoudige operatie die wordt uitgevoerd bij verdoofde muizen en vereist geen postoperatieve behandeling. Het hoornvlies puncteert zichzelf, sluit zichzelf af en geneest gedurende 3-5 dagen. Af en toe, tijdens het genezingsproces, wordt er wat ontgroening waargenomen rond de incisie, maar dit verdwijnt binnen een paar dagen. We hebben geen gevallen van anterieure synechie in de ogen van geopereerde dieren meegemaakt. We voeren de transplantatieprocedures uit in een schoon maar openluchtlaboratorium en zonder problemen met infecties in de geopereerde ogen. De inoculatie en implantatie van sferoïden in het oog brengen het zicht niet in gevaar en veranderen het gedrag van het ontvangende dier niet. In dit protocol gebruiken we isofluraan-anesthesie voor zowel transplantatiechirurgie als in vivo beeldvorming, die goed wordt verdragen bij muizen. Vanwege het dosisafhankelijke effect kan het tijdens de procedures gemakkelijk worden aangepast en heeft het het voordeel dat de slaap- en ontwaaktijden worden verkort. Er kunnen echter alternatieve injecteerbare anesthetica worden gebruikt. Na transplantatie geven we over het algemeen 1 maand de tijd om de sferoïden volledig te implanteren, te vasculariseren en te nerveren, voordat we behandelingsinterventies en in vivo beeldvorming uitvoeren. We hebben ook aangetoond dat transplantatie en implantatie mogelijk is met behulp van menselijke leversferoïden en immuungecompromitteerde ontvangende muizen10.

Het derde deel van deze methode is de in vivo beeldvorming van de getransplanteerde leversferoïden in de ACE. Dit protocol beschrijft de in vivo beeldvormingsopstelling, waarbij gebruik wordt gemaakt van microscopieapparatuur die vaak wordt aangetroffen in onderzoeksbeeldvormingsfaciliteiten. Bovendien zijn de gespecialiseerde materialen, zoals de muiskophouder en de plastic canule, nu in de handel verkrijgbaar. Met deze beeldvormingsopstelling zijn we in staat om z-secties vast te leggen en een driedimensionale reconstructie van de sferoïde architectuur te verkrijgen, afhankelijk van de diepte van laserpenetratie en fluorescentiedetectie. Het monitoren van de cellulaire functie in de getransplanteerde leversferoïden is gebaseerd op de visualisatie van fluorescerende eiwitten die rapporteren over celtypen, cellulaire functies en dynamiek. Dit beeldvormingsplatform kan dus worden geëxploiteerd met behulp van verschillende modaliteiten, alleen of in combinatie: (1) Fluorescerende sondes kunnen intraveneus worden toegediend, bijv. antilichamen om cellen te labelen en te volgen, evenals functionele kleurstoffen; (2) Leversferoïden kunnen worden gegenereerd uit cellen die zijn geïsoleerd uit reportermuismodellen die leverspecifieke fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, bijv. FUCCI-leversferoïden die rapporteren over de dynamiek van de celcyclus; (3) De vorming van leversferoïden in vitro kan worden gecombineerd met transfectie of transductie, om de sferoïden uit te rusten met fluorescerende eiwitten en biosensoren. bijv. adeno-geassocieerde virussen. In onze experimentele instellingen en door een enkel foton te gebruiken voor excitatie, is de beelddiepte die mogelijk is ongeveer 60-100 μm. Dit is echter afhankelijk van het laservermogen en de beschikbaarheid van multifotonbeeldvorming, de emissiekenmerken en gevoeligheid van de fluorescentiesonde van de detectoren, evenals de hoek van het oog waarin de sferoïde is geënt. Na beeldvorming kan de stroomafwaartse beeldanalyse worden uitgevoerd met behulp van populaire programma’s zoals Image J en Imaris. In het geval van de FUCCI-verslaggever kunnen bijvoorbeeld actieve cellen van de celcyclus in het groen worden geteld en vergeleken met het totale aantal rode cellen om de activiteit van de celcyclus in de getransplanteerde sferoïde te beoordelen. Bovendien kunnen met het ACE-beeldvormingsplatform stoffen op het oog worden aangebracht (in de vorm van oogdruppels) of rechtstreeks in de ACE worden geïnjecteerd om het transplantaat te behandelen en de reactie ervan te volgen. Post-mortem kunnen de getransplanteerde sferoïden gemakkelijk worden opgehaald door handmatige microdissectie en kunnen ze waardevolle informatie opleveren door middel van ex vivo-technieken , zoals immunofluorescentiekleuring, transcriptomische analyse, enz.10.

Deze techniek heeft bepaalde beperkingen. De eerste is dat uit onze ervaring blijkt dat de ontvangende muizen albino moeten zijn, d.w.z. een niet-gepigmenteerde iris moeten hebben. Bij implantatie worden de leversferoïden bedekt met een monolaag van iriscellen, wat de levensvatbaarheid of functie van de sferoïden niet beïnvloedt, maar het pigment in de iriscellen voorkomt beeldvorming. Een tweede overweging is de stabiliteit tijdens intraoculaire beeldvorming bij verdoofde muizen. Tijdens de in vivo beeldvormingssessies moeten de anesthesieconcentratie en ademhaling van het dier nauwlettend in de gaten worden gehouden om beweging tot een minimum te beperken. Desalniettemin zijn we met behulp van de hier aangegeven beeldvormingsinstellingen in staat om beeldvorming met hoge resolutie op het niveau van één cel te bereiken.

Samenvattend beschrijft dit protocol de implementatie van een niet-invasief in vivo beeldvormingsplatform van leverachtig weefsel dat in de ogen van muizen is geënt. We gebruiken eenvoudige procedures, gemeenschappelijke apparatuur en betaalbare materialen, waardoor het voor veel onderzoekers een haalbare aanpak is. Dit model combineert de voordelen van in vitro 3D-leversferoïden met het in vivo milieu en de optische toegankelijkheid die door de ACE wordt geboden om een waardevol platform te creëren voor het bestuderen van leverfysiologie en pathologie in fundamenteel onderzoek en preklinische omgevingen.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Zweedse Diabetes Vereniging, Fondsen van het Karolinska Institutet, de Zweedse Onderzoeksraad, de Novo Nordisk Foundation, de Family Erling-Persson Foundation, het Strategic Research Program in Diabetes aan het Karolinska Institutet, de Family Knut en Alice Wallenberg Foundation, de Jonas & Christina af Jochnick Foundation, de Zweedse Vereniging voor Diabetologie en ERC-2018-AdG 834860-EYELETS. De figuurtekeningen zijn gemaakt door FL-B met behulp van BioRender.com.

Materials

27 G butterfly needle Venofix 4056388
AAV8-CAG-GFP Charles River CV17169-AV9 Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol N/A N/A
Absorbent pad Attends 203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson #003574 and #007914 Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) Jackson #000058 Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH INFRAFRONTIER/EMMA EM:08395 Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in BD Medical 381212
Borosillicate standard glass cappilaries  World Precision Instruments 1B150-4
Cell lifter Corning 3008
Cell strainer, 70 µm Falcon 352350
Custom-made metal plate Hardware store N/A
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller Narshige Model PC-100
EDTA Sigma-Aldrich E9884
Electric heating pad Hardware store N/A
FBS Gibco N/A
GlutaMAX Gibco 35050061
Green CMFDA Abcam ab145459 Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe Hamilton 81242 Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red Gibco 14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective Leica N/A
HEPES Gibco 15630080
Induction chamber 0.8 L Univentor 8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) Gibco 41400045
Isoflurane Baxter N/A
Lectin DyLight-649 Invitrogen L32472 Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade Sigma-Aldrich 5401127001
Microelectrode beveler World Precision Instruments Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask Narshige Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate Thermo Fisher 174929
Oculentum simplex APL N/A
PBS 10x Gibco 14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium Gibco 14190144
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Percoll Sigma-Aldrich P1644
Peristaltic pump Ismatec Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing VWR VERN070540-07 Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL Invitrogen L34356 Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing Smiths Medical 800/100/140 Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat Hardware store N/A
Sodium chloride 0.9% Braun N/A
Solid Universal Joint Narshige Model UST-2
Stereomicroscope Leica Model M80
Suspension culture dish 35 mm Sarstedt 833900500
Temgesic Indivor N/A Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing VWR 228-1450 Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue Sigma-Aldrich T8154
Univentor 400 Anesthesia unit  Univentor 8323001
Upright laser scanning confocal microscope Leica Model TCS SP5 II
Viscotears Novartis N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red Gibco 22551089
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Sci Rep. 6, 25187 (2016).
  2. Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
  3. Oliva-Vilarnau, N., Vorrink, S. U., Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. A 3D cell culture model identifies Wnt/beta-catenin mediated inhibition of p53 as a critical step during human hepatocyte regeneration. Adv Sci (Weinh). 7 (15), 2000248 (2020).
  4. Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
  5. Kozyra, M., et al. Human hepatic 3D spheroids as a model for steatosis and insulin resistance. Sci Rep. 8 (1), 14297 (2018).
  6. Lauschke, V. M., Shafagh, R. Z., Hendriks, D. F. G., Ingelman-Sundberg, M. 3D primary hepatocyte culture systems for analyses of liver diseases, drug metabolism, and toxicity: Emerging culture paradigms and applications. Biotechnol J. 14 (7), e1800347 (2019).
  7. Shibuya, K., et al. The efficacy of the hepatocyte spheroids for hepatocyte transplantation. Cell Transplant. 30, 9636897211000014 (2021).
  8. Hamazaki, K., Doi, Y., Koide, N. Microencapsulated multicellular spheroid of rat hepatocytes transplanted intraperitoneally after 90% hepatectomy. Hepatogastroenterology. 49 (48), 1514-1516 (2002).
  9. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  10. Lazzeri-Barcelo, F., et al. Intraocular liver spheroids for noninvasive high-resolution in vivo monitoring of liver cell function. Nat Commun. 15 (1), 767 (2024).
  11. Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  12. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Mol Metab. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  13. Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for Primary Mouse Hepatocyte Isolation. STAR protocols. 1 (2), 100086 (2020).
  14. Baze, A., et al. Three-dimensional spheroid primary human hepatocytes in monoculture and coculture with nonparenchymal cells. Tissue Eng Part C Methods. 24 (9), 534-545 (2018).
  15. Mohar, I., Brempelis, K. J., Murray, S. A., Ebrahimkhani, M. R., Crispe, I. N. Isolation of nonparenchymal cells from the mouse liver. Methods Mol Biol. 1325, 3-17 (2015).

Tags

In Vivo ImagingLiver SpheroidsAnterior ChamberMouse EyeNon-invasive ImagingLongitudinal ImagingCellular ResolutionBiomedical ResearchLiver PhysiologyLiver PathologyIntravital ImagingBioluminescencePrimary Mouse Liver SpheroidsIrisCorneaConfocal Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lazzeri-Barcelo, F., Ciardo, P., Leibiger, B., Leibiger, I. B., Berggren, P., Moruzzi, N. In Vivo Imaging of Liver Spheroids Engrafted in the Anterior Chamber of the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (205), e66234, doi:10.3791/66234 (2024).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image