Um conjunto de formatos de meios simulados informados in situ para cultivo de microrganismos anaeróbios ambientalmente adquiridos

A maioria dos microrganismos permanece sem cultura; Isto é suportado pela grande disparidade entre as células observada através da microscopia contrastada pelos poucos microrganismos cultivados com sucesso usando placas de ágar. Staley e Konopka chamaram essa disparidade de “Anomalia da Grande Contagem de Placas”¹. A diversidade estimada não contabilizada é suportada por dados metagenômicos e metatranscriptômicos mostrando muitos gêneros novos distribuídos em curvas de abundância de postos de vários ambientes^{diferentes 2}. Microrganismos que têm sido observados (geralmente por sequenciamento aleatório de uma comunidade microbiana), mas não foram cultivados, têm sido referidos como “matéria escura microbiana”^3,4.

Na era da -ômica, a cultura de microrganismos continua sendo imperativa para avaliar completamente os dados genômicos e verificar a função/fenótipo dos genes presentes. O sequenciamento de microrganismos cultivados ainda é a única maneira de obter genomas completos com confiança até que tecnologias como a metagenômica shotgun e genomas montados em metagenomas do ambiente se tornem admissivelmente infalíveis⁵. Avaliações genômicas juntamente com microrganismos cultivados fornecem fortes inferências para a compreensão da “matéria escura microbiana”. Muitos membros da “matéria escura microbiana” desempenham funções cruciais que afetam a ciclagem de nutrientes e outros elementos e a produção de produtos naturais valiosos, apoiam sistemas ecológicos e executam serviços ecológicos. Do ponto de vista médico, cerca de metade de todos os produtos farmacêuticos atualmente comercializados são produtos e derivados de produtos de bactérias, e suspeita-se que o perfil de espécies não cultivadas revele os antibióticos do futuro. Para ter acesso a essa maioria inculta, uma variedade de metodologias de cultivo deve ser aumentada⁶. Entre os membros da “matéria escura microbiana”, os microrganismos anaeróbios oligotróficos são amplamente subnotificados e provavelmente possuem vias bioquímicas ecológica e industrialmente valiosas⁷, tornando-os importantes alvos de cultivo. No entanto, microrganismos oligotróficos anaeróbios são mais difíceis de cultivar do que seus homólogos aeróbios e copiotróficos devido a tempos de incubação mais longos frequentemente exigidos, condições fastidiosas (por exemplo, temperaturas in vitro não padronizadas específicas) e o uso de receitas de meios especializados.

As técnicas atuais de desenvolvimento para cultivar membros da “matéria escura microbiana”, incluindo novos microrganismos anaeróbios oligotróficos, melhoraram muito nossa compreensão e aumentaram a representação desses microrganismos dentro da árvore filogenética. As técnicas atuais que utilizam meios informados para o cultivo de novos microrganismos (isto é, meios derivados do conhecimento do(s) microrganismo(s) de interesse) podem ser separadas em três métodos distintos. O primeiro dos métodos envolve a remoção direta de uma seção discreta do ambiente para transferência para uma câmara de crescimento in vitro que já contém os microrganismos de interesse dentro de uma membrana. A seção discreta (por exemplo, água do mar) atua para fornecer aos microrganismos de interesse o habitat geoquímico que eles usam in situ, enquanto a membrana interrompe o movimento das células através (células de interesse permanecerão dentro; células estranhas que chegaram com a seção discreta permanecerão sem). Ao incluir compostos naturalmente disponíveis para atingir microrganismos em seu habitat natural, tais microrganismos podem ser cultivados⁸. O segundo método utiliza metatranscriptômica ou genômica para elucidar capacidades metabólicas, fornecendo pistas para parâmetros de cultivo estreitos para um planejamento de meio alvo. Esta abordagem fornece um perfil eco-fisiológico que pode ser usado para direcionar o enriquecimento de tipos específicos de microrganismos fora de um ambiente. As provisões do meio são atendidas para os genes identificados presentes que se presume suportarem o(s) microrganismo(s) ^alvo(s) para reduzir a diversidade de enriquecimento9,10. Uma ressalva é que a informação genômica não infere diretamente a expressão dos genes, enquanto a informação transcriptômica infere.

O terceiro método engloba mídias ambientalmente informadas e simuladas, distintas do primeiro, que não simula as mídias, mas utiliza diretamente o ambiente como fonte de mídia. Este terceiro método requer o reconhecimento ambiental da geoquímica de um local de campo contendo microrganismos de interesse. Com esse conhecimento, componentes primários e parâmetros físicos são identificados para produzir um meio simulado ambientalmente informado. O meio então recebe uma infusão direta de sedimento ou líquido contendo microrganismos do ambiente para o meio. Este método é particularmente valioso nos casos em que o microbiologista de cultura não tem acesso a quantidades suficientes de ambiente de origem (conforme necessário para o primeiro método) nem a dados metatranscriptômicos ou genômicos apropriados (conforme necessário para o segundo).

O protocolo a seguir é um exemplo do terceiro método; É informado e tem como objetivo simular ambientes de interesse. Três receitas de meios ingênuos visando diferentes culturas de microrganismos anaeróbios adquiridas no campo são apresentadas em paralelo dentro do protocolo. As três culturas representadas são culturas mistas originárias do solo (doravante, cultura mista de solo), culturas mistas originárias de um poço (doravante, cultura mista de poço) e um metanogênio isolado originário de um poço (doravante, metanogênio isolado de poço). As identidades e quantidades compostas nas receitas de mídia compartilhadas aqui são destinadas como um guia inicial; eles são capazes e incentivados a serem personalizados para o ambiente do leitor e microrganismos de interesse.