כימות נוגדנים אוטוריאקטיביים בעכברים על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית
Summary
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל בעל חיים של טרשת נפוצה (MS), אשר חולק עם המחלה האנושית תגובה אוטואימונית הומורלית חזקה. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול ELISA פשוט וגמיש לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברים מחוסנים EAE.
Abstract
אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא מודל מחלה המשחזר את ההפרעה האוטואימונית טרשת נפוצה (MS) ברמה היסטופתולוגית ומולקולרית. EAE מושרה על ידי חיסון חיות ניסוי באמצעות הזרקה תת עורית של פפטידי מיאלין קצרים יחד עם אדג’ובנטים ספציפיים כדי להגביר את התגובה החיסונית. בדומה למקבילו האנושי, עכברי EAE מפתחים נגעים דה-מיאלינטינג, חדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS), הפעלת גליה ופגיעה עצבית. גוף עקבי של ראיות תומך גם בתפקיד מכניסטי לתפקוד לקוי של תאי B באטיולוגיה של טרשת נפוצה ו- EAE. תאי B יכולים לשמש כתאים מציגי אנטיגן, כמו גם מקור עיקרי של ציטוקינים מעודדי דלקת ונוגדנים עצמיים. ב- EAE, נוגדנים נוצרים כנגד פפטידים של המיאלין ששימשו לגרימת המחלה. נוגדנים עצמיים כאלה הוכחו כמתווכים אובדן מיאלין או הפעלה מחדש של תאי T פתוגניים למערכת העצבים המרכזית. מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל מבוסס ELISA לכימות נוגדנים עצמיים בסרום של עכברי C57BL/6J שחוסנו בפפטיד מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין 35-55 (MOG35-55). השיטה המוצעת משמשת כלי רב עוצמה לחקר הספציפיות והעוצמה של התגובה ההומורלית החריגה בהקשר של דמיאלינציה אוטואימונית.
Introduction
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית כרונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) המאופיינת בחדירה מוקדית של תאי מערכת החיסון לפרנכימה במוח, פירוק נדן המיאלין העוטף אקסונים, הפעלת גליה ואובדן עצבי1. בנוסף לתפקיד המבוסס היטב של תאי T פתוגניים, קווי ראיות רבים הדגישו את מעורבותם של תאי B בתיווך התגובה האוטואימונית נגד מערכת העצבים המרכזית. תאי B עוברים התרחבות שבטית במוח הטרשת הנפוצה ונוגדנים כנגד מרכיבי המיאלין התגלו בתוך נגעים מיוצרים 2,3. ההפעלה הסלקטיבית של תאי B היקפיים עם תחילת המחלה תועדה לאחרונה, דבר המצביע על תפקיד משוער לתא חיסוני זה גם בהתחלת מחלה4. ההצלחה של טיפולים מדללי תאי B כגון נוגדנים חד-שבטיים נגד CD20 מאששת עוד יותר את הקשר המכניסטי בין תפקוד חריג של תאי B לבין דמיאלינציה אוטואימונית 5,6. מנקודת מבט מולקולרית, תאי B יכולים לתרום למחלה באמצעות הצגת אנטיגן עצמי, הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתיים וייצור נוגדנים אוטו-ריאקטיביים.
מודלים רבים של בעלי חיים פותחו כדי לשחזר תכונות ספציפיות של פנוטיפ הטרשת הנפוצה המורכב. ביניהם, אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) היא פרדיגמת in vivo הנפוצה ביותר ומסתמכת על חיסון של חיות ניסוי עם פפטידים קצרים הנגזרים מחלבוני מיאלין כגון גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים במיאלין (MOG) וחלבון בסיסי מיאלין (MBP)7. בעלי חיים מחוסנים של EAE מפתחים פתולוגיה דה-מיאלינציה הדומה לטרשת נפוצה בהיבטים רבים, כולל תגובה הומורלית חזקה נגד הפפטיד אנצפליטוגני8. מסיבה זו, מחקרי EAE סייעו לנתח את תפקודם של תאי B ונוגדנים עצמיים בהקשר של מחלה. לדוגמה, הוכח כי נוגדנים ספציפיים ל-MOG שבודדו מחולי טרשת נפוצה יכולים להחמיר את המהלך הקליני במודלים9 של EAE. יש לציין כי שאריות הפרולין במיקום 42 ב-MOG האנושי הוכחו כקריטיות לקביעת פתוגניות הנוגדנים העצמיים10. לאחרונה, נוגדנים עצמיים ספציפיים ל-MOG נמצאו כמקדמים מחלות לא רק על ידי תיווך אובדן מיאלין, אלא גם על ידי הגברת ההפעלה מחדש של תאי T אוטו-ריאקטיביים בתוך מערכת העצבים המרכזית11.
בהתחשב בחשיבות של תגובות נוגדנים באוטואימוניות CNS, מאמר זה מציג פרוטוקול מבוסס ELISA למדידה יעילה של רמות הנוגדנים האוטו-תגובתיים בסרום בעכברי C57BL/6J EAE שחוסנו בפפטיד MOG35-55. בחלק הראשון של הפרוטוקול תתואר השיטה לאיסוף סרום באמצעות ניקוב תוך לבבי. לאחר מכן, יפורטו הנהלים להקמת בדיקת ELISA ורכישת הנתונים. לבסוף, יידונו ניתוח נתונים ופרשנותם.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, דווח על פרוטוקול פשוט ויעיל מבוסס ELISA כדי לכמת במדויק את התגובה ההומורלית במודל חייתי רלוונטי של פתולוגיה של טרשת נפוצה. שיטה זו שימשה לאחרונה לתיאור התפקיד החדש של חלבון אטקסין-1 בשליטה על רמות הנוגדנים העצמיים בסרום בפרדיגמת MOG35-55/C57BL6J EAE12. בהקשר זה, יש לקחת בחשבון מספר גו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R03NS131908) ומשרד ההגנה באמצעות תוכנית המחקר לטרשת נפוצה תחת פרס מס ‘W81XWH-22-1-0517. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחבר ואינן בהכרח מאושרות על ידי משרד ההגנה. מחקר זה נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ של אוניברסיטת מזרח קרוליינה.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
Riferimenti
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
