Vi beskriver ett screeningsystems arbetsflöde och dataanalys för att utvärdera kemisk föreningstoxicitet baserat på zebrafiskembryots vibrationsrespons. Systemet registrerar zebrafiskembryons rörelser när de utsätts för vibrationsstimuli och möjliggör en integrerad utvärdering av allmän toxicitet/dödlighet och neuromuskulär toxicitet.
Vi utvecklade ett enkelt screeningsystem för utvärdering av neuromuskulär och generell toxicitet i zebrafiskembryon. Det modulära systemet består av elektrodynamiska givare ovanför vilka vävnadsodlingsskålar med embryon kan placeras. Flera sådana par av högtalare-vävnadskulturer kan kombineras. Vibrationsstimuli som genereras av de elektrodynamiska givarna inducerar en karakteristisk skrämsel- och flyktrespons hos embryona. En remdriven linjär drivning placerar sekventiellt en kamera ovanför varje högtalare för att registrera embryonas rörelser. På detta sätt kan förändringar i skrämselresponsen på grund av dödlighet eller neuromuskulär toxicitet hos kemiska föreningar visualiseras och kvantifieras. Vi presenterar ett exempel på arbetsflödet för screening av kemiska föreningar med hjälp av detta system, inklusive beredning av embryon och behandlingslösningar, drift av registreringssystemet och dataanalys för att beräkna referenskoncentrationsvärden för föreningar som är aktiva i analysen. Den modulära monteringen baserad på kommersiellt tillgängliga enkla komponenter gör detta system både ekonomiskt och flexibelt anpassningsbart till behoven hos särskilda laboratorieuppställningar och screeningändamål.
Under de senaste åren har zebrafiskar blivit mycket populära modellorganismer för utvärdering av kemiska föreningars effekter, och omfattar forskningsområden från läkemedelsutveckling till miljötoxikologi1. Som ryggradsdjur delar zebrafiskar många aspekter av sin genetiska uppsättning och övergripande fysiologi med människor 2,3. Därför är resultat som erhålls i denna modell ofta direkt relevanta för människors hälsa. Flera läkemedelskandidater som för närvarande befinner sig i kliniska prövningar har identifierats i sammansatta skärmar med zebrafisk4.
Toxicitetsbedömning är en viktig tillämpning där tester med zebrafiskens embryonala stadier är av intresse. Det finns olika testriktlinjer från Organisationen för ekonomiskt samarbete och utveckling (OECD) för användning av zebrafisk vid testning av miljötoxicitet 5,6. Zebrafiskembryonas ringa storlek och snabba utveckling gör dem mycket lämpliga för screening på en medelhög till hög genomströmningsskala 1,3,4. Toxikologiska effektmått som är inriktade på sådana screeningar inkluderar embryonala missbildningar och dödlighet7, endokrina störningar8, organtoxicitet9 och beteendebedömningar som tyder på neural toxicitet10,11. Beteendeanalyserna är möjliga eftersom zebrafiskembryon visar olika typer av motoriska svar på olika stimuli beroende på deras utvecklingsstadium. Till exempel visar embryon 1 dag efter befruktning (dpf) spontan svansringning12 och svarar på en sekvens av ljuspulser med en typisk sekvens av rörelser, den så kallade fotomotoriska responsen (PMR)10. Efter kläckningen, som vanligtvis sker cirka 48-72 timmar efter befruktningen (hpf), utvecklar de fritt simmande eleutheroembryona13 gradvis skrämsel- och flyktreaktioner på vibrationsstimuli med början runt 4 dpf14. Dessa reaktioner kännetecknas av en distinkt böjning i motsatt riktning mot stimulusriktningen (den så kallade C-böjen eller C-starten), som följs av en mindre motböjning och simbeteende 14,15,16,17. Embryonala beteenden styrs av neurala kretsar som använder olika neurotransmittorsystem, vilket gör det möjligt att undersöka kemiska sammansatta effekter som riktar sig mot dessa system. Till exempel avslöjade PMR-analysen effekterna av föreningar som stör kolinerg, adrenerg och dopaminerg signalering10, medan skrämselresponsen involverar kolinerga, glutamaterga och glycinerga neuroner 16,18. Dessutom kommer föreningar som skadar musklerna eller det neuromuskulära gränssnittet också att påverka dessa beteenden, liksom föreningar som är giftiga för innerörat/hårcellerna i sidolinjen 19,20. Att observera zebrafiskars rörelsebeteende som svar på ett stimuli är därför ett lämpligt sätt att bedöma inte bara neurotoxicitet utan även ototoxicitet och myotoxicitet. Poängsättning av rörelsebeteende fungerar också som en proxy för allmän toxicitet/dödlighetsbedömning eftersom döda embryon inte rör sig. Därmed representerar embryonala rörelsebeteenden en integrativ avläsning för en första klassens toxicitetsscreeningmetod, som indikerar dödliga och neuromuskulära sammansatta effekter i en uppställning. Med tanke på att eleutheroembryon redan är kapabla att metabolisera föreningar, kan tillvägagångssättet också upptäcka effekterna av metaboliska transformationsprodukter 7,21,22. Det är viktigt att notera att zebrafiskembryon inte betraktas som skyddade livsstadier enligt vissa djurskyddslagar förrän stadiet för fri utfodring efter 120 hpf13. De betraktas därför som ett alternativ till toxicitetstester på djur.
Figur 1: Inställning av systemet för vibrationsstart. (A) Översikt över systemet. Plattor med embryon som exponerats för testföreningarna placeras på den elektrodynamiska givaruppsättningen (“högtalare”). Kameran flyttas sekventiellt av den remdrivna linjära drivningen till inspelningspositionen ovanför målgivaren. (B) Detaljerad view av givaren/högtalaren med vävnadsodlingsskål insatt ovanpå. Plattorna belyses underifrån av en LED-ljusskiva på 4000-5000 lux. En LED-lampa bredvid högtalaren tänds medan stimulansen ges. C) Stillbild av video som spelats in av kameran vid stimulering av embryona. (D) Skärmdump av konfigurationsfilen. (E) Skärmdump av inspelningsprogramvarans gränssnitt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Här beskriver vi ett testprotokoll för utvärdering av sammansatta effekter på vibrationsskrämselresponsen med hjälp av en egenbyggd enkel testanordning baserad på vibrationsstimuli som genereras av elektrodynamiska givare i kombination med en automatiserad videoinspelning av flera fritt rörliga embryon i en vävnadsodlingsskål23. Systemet är modulärt och möjliggör sekventiell registrering från flera vävnadsodlingsskålar parallellt. I den uppställning som för närvarande används ger fem elektrodynamiska givare en vibrationsstimulus (500 Hz, varaktighet 1 ms) till vävnadsodlingsskålar som innehåller 20 embryon placerade ovanpå dem (figur 1). Plattorna belyses underifrån med 4000-5000 lux med LED-ljusskivor. En LED-lampa bredvid varje givare indikerar perioder av stimulusapplicering, och ett oscilloskop indikerar vågformer och frekvens för den applicerade stimulus (för detaljer, se Ref. 23). Embryonas beteende registreras av en höghastighetskamera (Table of Materials) med 1000 bilder per sekund (fps), som flyttas ovanför den riktade högtalaren av en remdriven linjär drivenhet. Denna inspelningshastighet krävs för att på ett tillförlitligt sätt lösa skrämselresponsen. Systemet är ett kostnadseffektivt och individuellt anpassningsbart alternativ till dagens kommersiella system. Det exakta arbetsflöde som beskrivs nedan utförs för närvarande inom ramen för initiativet för precisionstoxikologi24 för att fastställa lämpliga exponeringsförhållanden för insamling av OMICS-data från zebrafiskembryon som behandlats med en utvald uppsättning toxiska ämnen.
Vi presenterar arbetsflödet och dataanalysen för utvärdering av kemiska föreningar med hjälp av en specialbyggd zebrafiskembryovibrationsanalys. Arbetsflödet genererar robusta data som gör det möjligt att beräkna typiska parametrar som specificerar föreningens toxicitet, t.ex. riktmärkeskoncentration/dos (BMC/BMD). Modulariteten i installationen möjliggör anpassning till olika behov av genomströmning och utrymmeskrav. Eftersom systemet är tillverkat av billiga basala komponenter, efter en relativt enkel installation, ger det ett billigt alternativ till befintliga kommersiella system, som i allmänhet är utformade för flera analystyper samtidigt, förlitar sig på proprietär programvara och förblir relativt dyra.
Både dessa kommersiella system och andra specialtillverkade system möjliggör bedömning av enskilda embryon eller larver i flerbrunnsplattor (t.ex. 12-brunnars34, 16-brunnars32,35, 24-brunnars 20,33,36, 48-brunnars37, 96-brunnars 38,39,40,41,42 och till och med 384-brunnars [som 4×96-brunn]43), men den rumsliga begränsningen i brunnarna gör analysen av vissa dataparametrar för flyktresponsen (t.ex. tillryggalagd sträcka) mer utmanande. Dessutom, i vissa av dessa uppställningar, är avbildningen begränsad till en delmängd av plattans brunnar, vilket minskar genomströmningenmed 36,39. Avbildning av embryon i skålar möjliggör bättre bedömning av parametrar för flyktrespons och gör det möjligt att registrera beteendet hos flera embryon samtidigt (upp till 30 i en 6 cm skål, till exempel). Vanligtvis är skålbaserad avbildning begränsad till en maträtt per körning 44,45,46,47,48 (undantag utför avbildning parallellt på 6 rätter med en larv vardera 49 eller på 4 larver i 2 delade rätter50), en nackdel som kan lösas med parallella konstruktioner som i vårt fall. Vi har sammanfattat några egenskaper hos systemet som används i denna studie och andra kommersiella och skräddarsydda lösningar i tabell 22 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.
En fördel med metoden är att den fångar både dödlighet och beteendeförändringar, vilket kan öka prestandan för toxicitetsbedömningar. Till exempel, medan zebrafiskembryot akut toxicitetstest (FET)5 har visat sig förutsäga toxicitet i det akuta toxicitetstestet för vuxna fiskar53 ganska bra, förbättrades dess förutsägelsenoggrannhet genom att inkludera beteendeavläsningar54. Anledningen till detta är den svaga dödligheten som induceras av neuroaktiva föreningar som ses i fiskembryon, troligen på grund av bristen på andningssviktssyndrom som orsakar ökad toxicitet hos unga eller vuxna fiskar. Neuroaktivitet kan dock identifieras genom bedömning av beteende. Dessutom kan beteendeavläsningar också fånga upp myotoxiska och ototoxiska effekter samt andra, mer subtila toxiska effekter på fysiologin, som är subletala men ändå påverkar organismens beteendemässiga prestanda.
När analysen utförs är det viktigt att säkerställa korrekt hantering av föreningar samt att använda en homogent utvecklande sats zebrafiskembryon. Således bör användning av glasflaskor för förvaring av föreningar minimera minskningen av koncentrationerna av kemikalier, särskilt hydrofoba föreningar, på grund av absorbans till plastmaterial. När det gäller föreningar med hög absorptionspotential till “plast” polystyren kan glasplattor också användas för inkubationen. Rengöring av äggen i vävnadsodlingsskålar som används för insamling och avlägsnande av döda embryon är ett kritiskt steg för att säkerställa standardutveckling. Normal utvecklingshastighet är viktig, eftersom utvecklingsförseningar kan påverka mognaden hos neurala nätverk som ligger till grund för det bedömda beteendet14,33. För att möjliggöra jämförelse av sammansatta effekter bör ägg härledas från samma stam eftersom olika stammar har rapporterats uppvisa olika beteendeprofiler 38,55,56,57. Under exponeringen är det viktigt att inkubera embryona i en fuktkammare för att undvika överdriven avdunstning av E3-mediet, vilket skulle förändra de koncentrationer som testas.
E3-kontroller bör ingå i varje omgång för att bestämma utgångsvärdet för responsnivån för den specifika omgång embryon som används i testserien. Vanligtvis kör vi en platta med kontroller längs varje uppsättning med 5 mätningar. Som illustreras i figur 2D gör detta tillvägagångssätt det också möjligt att upptäcka batcher med suboptimala svar på grund av försenad utveckling eller av andra skäl, t.ex. genetiska bakgrundseffekter. I händelse av en oväntad brist på respons på stimulansen, se också upp för potentiella givarfel. Vanligtvis visar skrämselreaktionerna ett sigmoidalt koncentrationsresponsbeteende som möjliggör kurvanpassning med hjälp av en log-logistisk modell. I sällsynta fall med bifasiska svar kan dock andra modeller behöva användas, såsom Gaussiska eller Cedergreen-modeller. De är tillgängliga inom R-paketen drc och bdm 27,28.
Bristen på respons på vibrationsstimulus kan helt enkelt tyda på att embryona dör eller allvarligt försämrade livsfunktioner på grund av allmän cytotoxicitet, men kan också återspegla mer specifik toxicitet som riktar sig mot neurala kretsar för stimulusperception, integration och lokomotorisk produktion. Andra möjliga sammansatta effekter är störningar i det neuromuskulära gränssnittet eller i muskelstruktur och funktion. För att skilja mellan dessa möjligheter krävs ytterligare analyser. Till exempel kan musklernas strukturella integritet bedömas med en dubbelbrytningsanalys 58,59, och transgena linjer finns tillgängliga för att bedöma perturbans av muskel- och nervfunktion60,61. De inspelade videodata möjliggör dock redan en mer detaljerad analys av embryonas morfologi och beteenderespons som kan ge den första ytterligare informationen. Är det bara C-böjen som är nedsatt, eller all rörlighet? Finns det fortfarande rester av neuromuskulär aktivitet, vilket indikeras av svaga eller darrande svansrörelser? Går sådana förändrade beteenden hand i hand med förändringar i morfologi, såsom ödem eller ökad kroppskrökning? Dessutom kan parametrar som latenstid fram till C-böjningen eller den tillryggalagda sträckan under flyktresponsen utvärderas (se t.ex. ref. 44).
Det screeningprotokoll som beskrivs här möjliggör snabba och robusta utvärderingar av substanstoxicitet, med mervärdet att specifikt detektera icke-dödliga neurotoxiska, ototoxiska och myotoxiska föreningar. Det tillhandahållna analysarbetsflödet är enkelt att implementera och ger en robust avläsning. Modifieringar av stimulusprotokollen som används i vibrationsskrämselanalysen har använts för att ta itu med sammansatta effekter på mer komplexa aspekter av skrämselbeteende också, såsom prepulse inhibition (PPI)39,44 och habituation32,33, och kan anpassas till den elektrodynamiska givarbaserade stimulusuppställningen som används i denna studie.
En huvudsaklig tillämpning av screeningsystem baserade på skrämselrespons är bedömning av sammansatta effekter i kemiska screeningar, vilket är av relevans både för utvärdering av toxicitet hos människor och för läkemedelsutveckling 1,4,62. Genom att testa de tidiga livsstadierna hos en vattenlevande organism har de erhållna resultaten samtidigt direkt relevans för ekotoxikologisk riskbedömning63,64. Dessutom kan skrämselresponssystem användas för beteendefenotypning i genetiska skärmar 65,66,67,68,69. Vårt lättimplementerade och anpassningsbara system ger en prisvärd installation till mindre laboratorier som har för avsikt att genomföra sina egna specifika screeningprojekt inom dessa olika tillämpningsområden.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar för den utmärkta tekniska hjälpen från supportpersonalen vid IBCS-BIP:s fiskanläggning och screeningcenter. Detta arbete har fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 under Grant Agreement No 965406 (PrecisionTox). Dessa uppgifter återspeglar endast författarnas uppfattning, och Europeiska unionen kan inte hållas ansvarig för hur informationen i den används.
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm | Sigma-Aldrich | Z289744-1EA | Or comparable material |
High-speed camera | XIMEA | MQ013MG-ON USB 3 | |
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap | VWR | 215-3261 | Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 10 µL | SARSTEDT | 70.3010.210 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 1000 µL | SARSTEDT | 70.3050.100 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 20 µL | SARSTEDT | 70.3020.210 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 200 µL | SARSTEDT | 70.3030.100 | Or comparable material |
Serological pipette 10 mL | SARSTEDT | 86.1254.001 | Or comparable material |
Serological pipette 25 mL | SARSTEDT | 86.1685.001 | Or comparable material |
Serological pipette 5 mL | SARSTEDT | 86.1253.001 | Or comparable material |
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) | Greiner bio-one | 628102 | Or comparable material |
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) | SARSTEDT | 83.3902.500 | Or comparable material |
Transfer pipette 6 mL | SARSTEDT | 86.1175 | Or comparable material |
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP | SARSTEDT | 62.554.502 | Or comparable material |
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP | SARSTEDT | 62.5472.54 | Or comparable material |