Vi beskriver et screeningssystems arbejdsgang og dataanalyse til evaluering af kemisk sammensat toksicitet baseret på zebrafiskens embryo vibration startle response. Systemet registrerer zebrafiskembryoners bevægelser efter eksponering for en vibrationsstimulus og giver mulighed for en integreret evaluering af generel toksicitet/dødelighed og neuromuskulær toksicitet.
Vi udviklede et simpelt screeningssystem til evaluering af neuromuskulær og generel toksicitet i zebrafiskembryoner. Det modulære system består af elektrodynamiske transducere, over hvilke vævskulturskåle med embryoner kan placeres. Flere sådanne højttaler-vævskulturskålpar kan kombineres. Vibrationsstimuli genereret af de elektrodynamiske transducere inducerer et karakteristisk forskrækkelses- og flugtrespons i embryonerne. Et bæltedrevet lineært drev placerer sekventielt et kamera over hver højttaler for at optage embryonernes bevægelse. På denne måde kan ændringer i startleresponsen på grund af dødelighed eller neuromuskulær toksicitet af kemiske forbindelser visualiseres og kvantificeres. Vi præsenterer et eksempel på arbejdsgangen for screening af kemiske forbindelser ved hjælp af dette system, herunder forberedelse af embryoner og behandlingsopløsninger, drift af registreringssystemet og dataanalyse til beregning af benchmarkkoncentrationsværdier for forbindelser, der er aktive i assayet. Den modulære samling baseret på kommercielt tilgængelige enkle komponenter gør dette system både økonomisk og fleksibelt tilpasningsdygtigt til behovene i bestemte laboratorieopsætninger og screeningsformål.
I de senere år er zebrafisk blevet meget populære modelorganismer til evaluering af kemiske sammensatte effekter, der omfatter forskningsområder fra lægemiddeludvikling til miljøtoksikologi1. Som hvirveldyr deler zebrafisk mange aspekter af deres genetiske sammensætning og generelle fysiologi med mennesker 2,3. Derfor er resultater opnået i denne model ofte direkte relevante for menneskers sundhed. Flere lægemiddelkandidater, der i øjeblikket er i kliniske forsøg, er blevet identificeret i sammensatte skærme ved hjælp af zebrafisk4.
Toksicitetsvurdering er en vigtig anvendelse, hvor forsøg med zebrafiskens embryonale stadier er af interesse. Der findes forskellige retningslinjer for test fra Organisationen for Økonomisk Samarbejde og Udvikling (OECD) for anvendelse af zebrafisk i miljøtoksicitetstest 5,6. Zebrafiskembryonernes lille størrelse og hurtige udvikling gør dem særdeles velegnede til screening på en medium til høj gennemstrømningsskala 1,3,4. Toksikologiske endepunkter, som sådanne screeninger er rettet mod, omfatter embryonale misdannelser og dødelighed7, hormonforstyrrendevirkninger 8, organtoksicitet9 og adfærdsmæssige vurderinger, der indikerer neural toksicitet10,11. De adfærdsmæssige analyser er mulige, fordi zebrafiskembryoner viser forskellige typer lokomotoriske reaktioner på forskellige stimuli afhængigt af deres udviklingsstadium. For eksempel viser embryoner 1 dag efter befrugtning (dpf) spontan halespiral12 og reagerer på en sekvens af lysimpulser med en typisk sekvens af bevægelser, det såkaldte fotomotoriske respons (PMR)10. Efter udklækning, der typisk forekommer omkring 48-72 timer efter befrugtning (hpf), udvikler de frit svømmende eleutheroembryoner13 gradvist skræmmende og undslipper reaktioner på vibrationsstimuli, der starter omkring 4 dpf14. Disse reaktioner er kendetegnet ved en karakteristisk bøjning til retningen modsat stimulusretningen (den såkaldte C-bøjning eller C-start), som efterfølges af en mindre modbøjning og svømmeadfærd 14,15,16,17. Især styres embryonal adfærd af neurale kredsløb ved hjælp af forskellige neurotransmittersystemer, hvilket giver mulighed for at undersøge kemiske forbindelseseffekter rettet mod disse systemer. For eksempel afslørede PMR-analysen virkningerne af forbindelser, der interfererer med kolinerge, adrenerge og dopaminerge signalering10, mens startleresponsen involverer kolinerge, glutamaterge og glycinerge neuroner 16,18. Desuden vil forbindelser, der beskadiger musklerne eller den neuromuskulære grænseflade, også påvirke denne adfærd, ligesom forbindelser, der er giftige for hårcellerne i det indre øre / sidelinjen19,20. Observation af zebrafisk lokomotorisk adfærd som reaktion på en stimulus er således et egnet middel til at vurdere ikke kun neurotoksicitet, men lige så ototoksicitet og myotoksicitet. Scoring lokomotorisk adfærd tjener også som en proxy for generel toksicitet / dødelighed vurdering, da døde embryoner ikke bevæger sig. Derved repræsenterer embryonal bevægelsesadfærd en integreret aflæsning for en første niveau toksicitetsscreeningsmetode, hvilket indikerer dødelige og neuromuskulære sammensatte virkninger i en opsætning. Da eleutheroembryonerne allerede er i stand til at metabolisere forbindelser, kan fremgangsmåden også påvise virkningerne af metaboliske transformationsprodukter 7,21,22. Det er vigtigt, at zebrafiskembryoner ikke betragtes som beskyttede livsstadier i henhold til visse dyrebeskyttelseslovgivninger før stadiet med fri fodring efter 120 hpf13. De betragtes derfor som et alternativ til dyretoksicitetstest.
Figur 1: Opsætning af vibrationsstartle response-system. (A) Oversigt over systemet. Plader med embryoner udsat for testforbindelserne placeres på det elektrodynamiske transducerarray (“højttalere”). Kameraet flyttes sekventielt af det bæltedrevne lineære drev til optagepositionen over den målrettede transducer. (B) Detaljeret billede af transduceren/højttaleren med vævskulturskålen indsat øverst. Pladerne belyses nedefra af et LED-lysark ved 4000-5000 lux. Et LED-lys ved siden af højttaleren lyser, mens stimulus gives. (C) Stillbillede af video optaget af kameraet efter stimulering af embryonerne. (D) Skærmbillede af konfigurationsfilen. (E) Skærmbillede af optagelsessoftwarens grænseflade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Her beskriver vi en testprotokol til evaluering af sammensatte virkninger på vibrationsstartleresponsen ved hjælp af en intern bygget simpel testenhed baseret på vibrationsstimuli genereret af elektrodynamiske transducere kombineret med en automatiseret videooptagelse af flere frit bevægelige embryoner i en vævskulturskål23. Systemet er modulært og giver mulighed for sekventiel optagelse fra flere vævskulturretter parallelt. I den aktuelt anvendte opsætning tilvejebringer fem elektrodynamiske transducere en vibrationsstimulus (500 Hz, varighed 1 ms) til vævskulturskåle indeholdende 20 embryoner placeret oven på dem (figur 1). Pladerne belyses nedefra ved 4000-5000 lux med LED-lysplader. Et LED-lys ved siden af hver transducer angiver perioder med stimuluspåføring, og et oscilloskop angiver bølgeformer og frekvens af den påførte stimulus (for detaljer, se ref. 23). Embryonernes opførsel registreres af et højhastighedskamera (materialetabel) med 1000 billeder pr. Sekund (fps), som flyttes over den målrettede højttaler med et bæltedrevet lineært drev. Denne optagehastighed er nødvendig for pålideligt at løse startle-responsen. Systemet giver et billigt, individuelt tilpasningsdygtigt alternativ til nuværende kommercielle systemer. Den præcise arbejdsgang, der er beskrevet nedenfor, udføres i øjeblikket inden for rammerne af initiativet om præcisionstoksikologi24 for at bestemme passende eksponeringsbetingelser for indsamling af OMICS-data fra zebrafiskembryoner behandlet med et udvalgt sæt toksiske stoffer.
Vi præsenterer arbejdsgangen og dataanalysen til evaluering af kemiske forbindelser ved hjælp af en specialbygget zebrafisk embryo vibration startle assay opsætning. Arbejdsprocessen genererer robuste data, der gør det muligt at beregne typiske parametre, der specificerer sammensat toksicitet, såsom benchmarkkoncentration/dosis (BMC/BMD). Opsætningens modularitet muliggør tilpasning til forskellige behov for gennemstrømning og pladskrav. Da systemet er lavet af billige basale komponenter, efter en relativt enkel opsætning, giver det et billigt alternativ til eksisterende kommercielle systemer, som generelt er designet til flere analysetyper på én gang, er afhængige af proprietær software og forbliver relativt dyre.
Både disse kommercielle systemer og andre skræddersyede systemer giver mulighed for vurdering af enkelte embryoner eller larver i multibrøndplader (f.eks. 12-brønd34, 16-brønd32,35, 24-brønd 20,33,36, 48-brønd 37, 96-brønd 38,39,40,41,42 og endda 384-brønd [som 4×96 brønd]43), men den rumlige begrænsning i brøndene gør analysen af nogle dataparametre for flugtresponsen (f.eks. tilbagelagt afstand) mere udfordrende. Desuden er billeddannelse i nogle af disse opsætninger begrænset til en delmængde af pladens brønde, hvilket reducerer gennemstrømningen36,39. Billeddannelse af embryoner i skåle giver mulighed for bedre vurdering af escape response-parametre og gør det muligt at registrere flere embryoners adfærd på én gang (f.eks. op til 30 i en 6 cm skål). Normalt er skålbaseret billeddannelse begrænset til en skål pr. Kørsel 44,45,46,47,48 (undtagelser udfører billeddannelse parallelt på 6 retter med en larve hver 49 eller på 4 larver i 2 splitskåle50), en ulempe, der kan løses ved parallelle designs som i vores tilfælde. Vi har opsummeret nogle karakteristika ved det system, der anvendes i denne undersøgelse, og andre kommercielle og skræddersyede løsninger i tabel 2 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.
En fordel ved metoden er en aflæsning, der fanger både dødelighed og adfærdsændringer, hvilket kan øge udførelsen af toksicitetsvurderinger. For eksempel, mens zebrafiskfiskens embryo akutte toksicitetstest (FET)5 har vist sig at forudsige toksicitet i den akutte toksicitetstest for voksne fisk53 ganske godt, blev dens forudsigelsesnøjagtighed forbedret ved at inkludere adfærdsaflæsninger54. Årsagen til dette er den svage dødelighed forårsaget af neuroaktive forbindelser, der ses i fiskeembryoner, sandsynligvis på grund af manglen på respirationssvigtsyndrom, der forårsager øget toksicitet hos unge eller voksne fisk. Neuroaktivitet kan dog identificeres ved vurdering af adfærd. Desuden kan adfærdsmæssige aflæsninger også fange myotoksiske og ototoksiske virkninger såvel som andre, mere subtile toksiske virkninger på fysiologi, som er subletale og alligevel påvirker organismens adfærdsmæssige ydeevne.
Ved udførelse af analysen er det afgørende at sikre korrekt håndtering af forbindelser samt anvendelse af et homogent udviklende parti zebrafiskembryoner. Anvendelse af hætteglas af glas til opbevaring af forbindelser bør således minimere faldet i koncentrationer af kemikalier, især hydrofobe forbindelser, på grund af absorbans over for plastmateriale. I tilfælde af forbindelser med højt absorptionspotentiale til “plastisk” polystyren kan glasplader også anvendes til inkubation. Rensning af æggene i vævskulturskålene, der anvendes til indsamling og fjernelse af døde embryoner, er et kritisk skridt for at sikre standardudvikling. Normal udviklingshastighed er vigtig, da udviklingsforsinkelser kan påvirke modenheden af neurale netværk, der ligger til grund for den vurderede adfærd14,33. For at muliggøre sammenligning af sammensatte virkninger bør æg også stamme fra den samme stamme, da forskellige stammer er rapporteret at præsentere forskellige adfærdsprofiler 38,55,56,57. Under eksponeringen er det vigtigt at inkubere embryonerne i et befugtet kammer for at undgå overdreven fordampning af E3-mediet, hvilket ville ændre de testede koncentrationer.
E3-kontroller bør indarbejdes i hver serie for at bestemme basisresponsniveauet for den pågældende batch af embryoner, der anvendes i testserien. Typisk kører vi en plade med kontroller langs hvert sæt af 5 målinger. Som illustreret i figur 2D giver denne tilgang også mulighed for påvisning af batcher med suboptimale responser på grund af forsinket udvikling eller af andre årsager, såsom genetiske baggrundseffekter. I tilfælde af en uventet mangel på reaktion på stimulus skal du også passe på potentiel transducerfejl. Typisk viser startle-svarene en sigmoidal koncentrationsresponsadfærd, der muliggør kurvetilpasning ved hjælp af en log-logistisk model. I sjældne tilfælde med bifasiske reaktioner kan det dog være nødvendigt at anvende andre modeller, såsom Gaussiske eller Cedergreen-modeller. De er tilgængelige i R-pakkerne drc og bdm 27,28.
Manglen på respons på vibrationsstimulus kan simpelthen indikere embryonernes død eller alvorligt forringede livsfunktioner på grund af generel cytotoksicitet, men kan også afspejle mere specifik toksicitet rettet mod neurale kredsløb af stimulusopfattelse, integration og lokomotorisk output. Andre mulige sammensatte virkninger er interferens med den neuromuskulære grænseflade eller med muskelstruktur og funktion. For at skelne mellem disse muligheder er yderligere analyser nødvendige. For eksempel kan musklernes strukturelle integritet vurderes med et birefringensassay58,59, og transgene linjer er tilgængelige for at vurdere forstyrrelse af muskulær og neural funktion60,61. Imidlertid giver de optagede videodata allerede mulighed for en mere detaljeret analyse af embryonernes morfologi og adfærdsmæssige respons, der kan give de første yderligere oplysninger. Er kun C-bøjningen svækket eller al bevægelighed? Er der stadig rester af neuromuskulær aktivitet til stede, som indikeret af svage eller skælvende halebevægelser? Går sådanne ændrede adfærd sammen med ændringer i morfologi, såsom ødem eller øget kropskrumning? Derudover kan parametre som latenstid indtil C-bøjningen eller den tilbagelagte afstand under flugtresponsen evalueres (se f.eks. ref. 44).
Den screeningsprotokol, der er beskrevet her, giver mulighed for hurtige og robuste evalueringer af sammensat toksicitet med den merværdi, at den specifikt påviser ikke-dødelige neurotoksiske, ototoksiske og myotoksiske forbindelser. Den leverede analysearbejdsgang er nem at implementere og giver en robust udlæsning. Ændringer af stimulusprotokollerne, der anvendes i vibrationsstartle-assayet, er også blevet brugt til at adressere sammensatte virkninger på mere komplekse aspekter af startleadfærd, såsom præpulshæmning (PPI)39,44 og tilvænning32,33, og kunne tilpasses den elektrodynamiske transducerbaserede stimulusopsætning, der blev brugt i denne undersøgelse.
En hovedanvendelse af startle-response-baserede screeningssystemer er vurderingen af sammensatte virkninger i kemiske screeninger, hvilket er relevant både for human toksicitetsevaluering og lægemiddeludvikling 1,4,62. Ved at teste en akvatisk organismes tidlige livsstadier har de opnåede resultater samtidig direkte relevans for økotoksikologisk risikovurdering63,64. Derudover kan startle response-systemer bruges til adfærdsmæssig fænotypning i genetiske skærme 65,66,67,68,69. Vores let implementerbare og tilpasningsdygtige system giver en overkommelig opsætning til mindre laboratorier, der har til hensigt at gennemføre deres egne specifikke screeningsprojekter inden for disse forskellige anvendelsesområder.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender heldigvis den fremragende tekniske assistance fra supportpersonalet på IBCS-BIP fiskefacilitet og screeningscenter. Dette arbejde har modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftale nr. 965406 (PrecisionTox). Denne produktion afspejler kun forfatternes synspunkt, og Den Europæiske Union kan ikke holdes ansvarlig for enhver brug, der måtte blive gjort af oplysningerne deri.
Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm | Sigma-Aldrich | Z289744-1EA | Or comparable material |
High-speed camera | XIMEA | MQ013MG-ON USB 3 | |
Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap | VWR | 215-3261 | Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 10 µL | SARSTEDT | 70.3010.210 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 1000 µL | SARSTEDT | 70.3050.100 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 20 µL | SARSTEDT | 70.3020.210 | Or comparable material |
Pipette tip, working volume: 200 µL | SARSTEDT | 70.3030.100 | Or comparable material |
Serological pipette 10 mL | SARSTEDT | 86.1254.001 | Or comparable material |
Serological pipette 25 mL | SARSTEDT | 86.1685.001 | Or comparable material |
Serological pipette 5 mL | SARSTEDT | 86.1253.001 | Or comparable material |
Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) | Greiner bio-one | 628102 | Or comparable material |
Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) | SARSTEDT | 83.3902.500 | Or comparable material |
Transfer pipette 6 mL | SARSTEDT | 86.1175 | Or comparable material |
Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP | SARSTEDT | 62.554.502 | Or comparable material |
Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP | SARSTEDT | 62.5472.54 | Or comparable material |