开发了一种保护测定法来监测视网膜血管系统对糖尿病/糖尿病视网膜病变相关损伤(如氧化应激和细胞因子)死亡的恢复能力。
糖尿病视网膜病变 (DR) 是一种复杂且进行性的眼部疾病,其发病机制有两个不同的阶段。第一阶段涉及失去对糖尿病引起的视网膜损伤的保护,而第二阶段则集中在这种损伤的积累上。传统检测主要侧重于评估毛细血管变性,毛细血管变性表明损伤的严重程度,主要针对 DR 的第二阶段。然而,它们只能间接地提供关于视网膜血管系统的保护机制是否受到损害的见解。为了解决这一局限性,开发了一种新的方法来直接评估视网膜的保护机制 – 特别是它对糖尿病引起的损伤(如氧化应激和细胞因子)的恢复力。这种保护性检测虽然最初是为糖尿病视网膜病变设计的,但在生理和病理环境中都有更广泛的应用潜力。总之,了解糖尿病视网膜病变的发病机制涉及识别保护丧失和损伤积累的双重阶段,这种创新的保护测定法为研究提供了有价值的工具,并可能扩展到其他医疗条件。
糖尿病视网膜病变 (DR) 是糖尿病 (DM) 的微血管并发症之一,也是发达国家工作年龄个体失明的主要原因1。糖尿病视网膜病变的主要危险因素是高血糖的持续时间和程度2,3,4。虽然 DM 会导致视网膜的血管和神经成分功能障碍5,但 DR 的诊断基于视网膜脉管系统的形态特征6。
高血糖诱导的氧化应激是 DR 发病机制的驱动因素之一 7.氧化应激的增加会导致广泛的损伤,从而损害线粒体的功能,从而进一步增加活性氧的水平。这些事件伴随着视网膜血管渗漏、炎性细胞因子水平升高以及视网膜内神经和血管细胞类型的死亡。血管细胞的丧失,以及视网膜广泛毛细血管网络的功能,导致缺氧,这是各种反应的有力刺激5.这些反应包括驱动通透性和血管生成的血管内皮生长因子 (VEGF) 表达增加、DR 晚期、威胁视力的阶段的主要特征 – 糖尿病性黄斑水肿和增殖性糖尿病视网膜病变6。
DR 的某些特征表明,生物体(患者和实验动物)具有抵抗这种适应症的内在能力。患者在发展为危及视力的 DR8、9、10、11、12、13 之前会经历数十年的 DM。虽然 DM 的啮齿动物模型不会发展为 DR14 的高级、威胁视力的阶段,但表现出的初始/轻度 DR 形式仅在 DM15,16 数周或数月后才会出现。此外,在患者和实验动物中,DR 都是进行性的,并且视网膜功能障碍/损伤随着 DM 持续时间的延长而增加。最后,一些糖尿病患者从未发生过 DR。在某些情况下,这是因为这些人经历糖尿病的时间不够长,无法发展 DR。在其他情况下,这是因为它们对 DR 表现出非凡的抵抗力;与 Medalist 研究的参与者一样,他们在 DM17 50 年或更长时间后没有发生 DR。尽管有如此令人信服的支持,支持DR保护的存在及其巨大的转化相关性,但尚未积极研究保护背后的机制。
本文所述的保护测定旨在促进研究为什么 DR 在糖尿病小鼠中从 DM 发作延迟。该测定法应用于 DM 和非 DM 小鼠的关键步骤包括 (1) 对眼睛(离体 或 体内)提供次最大死亡诱导损伤,(2) 分离视网膜脉管系统,(3) 用 TUNEL 和 DAPI 染色脉管系统,(4) 拍摄所得图像并量化 TUNEL/DAPI 双阳性物种的百分比。
在这项研究中,建立了一种测定法来检测由 DM/DR 相关损伤(如缺血/氧化应激和细胞因子)诱导的视网膜血管系统对死亡的抵抗/脆弱性。本手稿提供了该测定的详细描述,该测定是对几种已发表的方案 19,20,21 的修改。
该协议包括几个关键阶段。首先,必须仔细解剖视网膜,确保血管网络的保存并防止大量撕裂。这可以通过在角膜缘后方 2-3 毫米处切开一个切口来实现,因为视网膜紧紧地粘附在锯齿上,并且将其分离具有挑战性。其次,在整个过程中将胰蛋白酶浸入 YL 胰蛋白酶溶液中,将所有与血管接触的器械(例如,单毛刷、转移移液管和镊子)涂上胰蛋白酶。这可以防止脉管系统粘附在本协议中使用的器械上。第三,由于微血管系统在正常光线下几乎看不见,因此在碎片吸入和转移到显微镜载玻片时需要提高警惕,以防止意外丢失。
视网膜各层的适当程度的酶消化至关重要;消化不足会阻止神经元组织与血管网络分离,而过度消化会溶解血管丛。据报道,从 1 小时19 到过夜 23 的各种消化时间。根据观察,与2小时,3小时和4小时的持续时间相比,4小时和15分钟的消化时间产生最有利的结果。将消化时间延长到这一点之后不太可能增强该过程,反而可能会损害脉管系统的完整性。
如果消化的视网膜粘附在单发刷上,请多次将头发浸入 YL 胰蛋白酶溶液中。这样可以减少刷子的粘性区域。如果发刷仍然粘附在血管组织上,则检查其是否有残留的玻璃体碎片,并用镊子将其取出。
完全切除玻璃体的最佳时机是在消除光感受器之后,但在切除剩余的神经和神经胶质组织之前。视网膜保持刚性,直到光感受器被移除。在这个阶段提取玻璃体可能会撕裂视网膜/脉管系统。残留的神经和神经胶质组织的脆弱层在保持血管结构的弯曲形式方面起着关键作用。当玻璃体与视神经分离时,它们可防止视网膜在其中心撕裂。
如果孤立的脉管系统根本没有粘附在显微镜载玻片上,则表明预计会发生粘连的载玻片部分很脏。尝试在载玻片表面移动容器以找到粘性点,切换到不同的载玻片或仔细清洁载玻片并重试。如果容器在展开成碗状之前粘在载玻片上,请从载玻片上提起脉管系统,使其再次自由漂浮在水中。使用反复浸入YL胰蛋白酶溶液中的镊子执行此步骤。
已经报道了几种用于分离脉管系统的替代技术,这些技术不适合本文所述的保护测定。例如,渗透裂解已被用于从未固定的视网膜样本中分离脉管系统,从而促进了组织的生化研究24,25。然而,该过程可能无法保留脉管系统的解剖结构以及本文采用的方法。类似地,虽然分离大段微血管系统的组织打印方法可以分析脉管系统的电渗结构26,但整个血管床通常不会恢复。
开发该测定法是因为现有的毛细血管变性监测方法无法解决保护问题。毛细血管变性发生在长期糖尿病后,提示是否发生了 DR。除了诊断 DR 外,该结果还有助于评估药物/疗法是否能预防 DR。然而,现有的毛细血管变性检测并不能说明该药剂的潜在作用机制。这种药物可以防止驱动DR的病理事件,例如氧化应激或细胞因子增加。或者,该试剂可以通过增强对氧化应激和细胞因子的恢复力和/或促进损伤的修复来加强保护。这种新的保护测定可用于确定给定疗法的有益效果是否涉及加强防止 DM 相关死亡的内源性系统。
这种保护测定的一个缺点是它不能区分视网膜血管内的两种细胞类型:内皮细胞 (EC) 和周细胞 (PC)。虽然它们在PASH染色切片中的细胞核外观是细胞类型特异性的(图6),但并非每个细胞核都显示出诊断特征。大约 30% 的细胞核不能明确定义为 EC 或 PC,至少部分原因是从 PASH 染色样品中获得的二维图像不能完全解析血管丛的三维结构。这一障碍可以通过额外的分析来克服,例如使用细胞类型特异性标记物进行免疫荧光染色。这种区分两种细胞类型的图像可以与TUNEL共同染色,以确定每种血管细胞类型的耐药性/脆弱性。
这种以血管为重点的测定不提供有关神经视网膜的任何信息。可以开发其他检测方法来提供此类信息。例如,可以生成整个视网膜的单个细胞悬浮液,而不是分离视网膜脉管系统,然后分析(通过荧光激活的细胞分选)抵抗力/脆弱性。包括细胞类型特异性标记物(神经和血管)以及细胞死亡指标将提供更完整的视网膜细胞类型,这些细胞类型具有保护免受DM / DR介导的死亡的能力。
总之,本文中描述的保护测定提供了一种强有力的方法来研究导致小鼠 DM 发作和 DR 表现之间延迟的机制。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了伊利诺伊州防盲协会、美国国立卫生研究院(EY031350和EY001792)的资助,以及预防失明研究基金会的无限制资助。
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
24-well plates | Falcon | 353047 | |
33 G needle | Hamilton | customized | |
Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
Periodic acid | Sigma | 3951 | |
Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
Xylene | Sigma | 65351-M | |
YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |