对形成冠层的巨型海带进行野外采集和实验室维护，以促进恢复

本协议中描述的海带组织由加州鱼类和野生动物部根据 S-202020004-20205-001 许可证收集和监督。 1. 设施和材料的准备 确保海带养殖设施能够保持温度（10-15°C），提供全光谱光（0-180μmol光子m-2 s-1）和过滤曝气（0.2μm孔径）。使用带有内置插座或接入端口的培养箱系统，用于电线和管道、灯和气源（图 1）。如果孵化器系统不在项目的范围、预算或预期规模范围内，请使用由凉爽的天然海水或冷却器回火的水浴（图 2）。具体细节请参考 材料表 。将温度计放入生长培养基中或使用温度枪确保温度在 10-18 °C 之间。注：饲养温度因地和季节而异，为30。 通过更改光源上的定时设置或使用机械计时器，将全光谱光编程为 12 小时光周期：12 小时暗。在砾石附近的表面以下使用防水光合有效辐射 （PAR） 量子计测量光强度，并使用可调光光源或通过分层玻璃纸（在营养配子体培养的情况下，参见 第 9 节）或在光源上网格（有关光强度调整的详细信息，请参阅 第 6.3 节）进行调整。 孢子形成后一天使用气泵31 确保适当的曝气。使用过滤器（0.2μm孔径）减少空气中的细菌污染。注意：对于“绿色砾石” 培养，曝气压力必须足以使所有培养容器中的水循环，同时不干扰早期海带与播种基质的附着。如果存在膨胀的配子体生物量（见 第 9.2 节），曝气压力必须足以维持悬浮在培养基中的配子体。 对材料和工位进行消毒。提前准备这些（见 材料表）。使用70%异丙醇清洁表面。如果可能的话，在 “绿色砾石”苗圃外处理生殖组织并清洁收集设备。 使用以下灭菌方法：使用实验室级洗涤剂冲洗，然后用蒸馏水彻底冲洗，浸泡在稀释的漂白剂溶液中（根据制造商的说明），然后用蒸馏水彻底冲洗，并使用适当的设置（玻璃器皿或器械）进行高压灭菌器。灭菌后，材料可以存放在密封容器中或用箔纸包裹。 使用实验室级洗涤剂擦洗和清洁带盖的容器，然后用蒸馏水彻底冲洗。注意：带盖的培养容器将有助于减少生长培养基的蒸发。将盖子稍微打开以允许空气交换，或使用止回阀以减少空气污染。如果没有带盖的容器，请用石蜡膜等热塑性塑料密封培养容器，并打孔 2-3 个孔。如果使用较大的水箱，请使用由透明塑料制成的防蒸发盖。 确保砾石具有纹理或轻微凹陷的表面，因为配子体更有可能保留在具有高粗糙度的基质上 32,33。擦洗并冲洗砾石，直到水变清，以去除任何灰尘或碎屑。将砾石浸泡在10%稀释的漂白剂溶液中至少24小时，并用过滤灭菌的海水冲洗（参见第2.1节）。或者，在擦洗和冲洗后，将砾石浸泡在去离子 （DI） 水中1 周 32.注意：理想情况下，使用当地收获的基质来减少对修复部位的污染。或者，建议使用水族箱级砾石。避免石灰石等钙质基质，这会导致移植海带的组织漂白和随后的死亡32. 2.生长培养基的制备 根据资源可用性，根据以下方法过滤和消毒海水。计算每周更新培养容器所需的过滤灭菌海水量（见 第 7 节），并相应地安排此过滤/灭菌任务。将大批量过滤灭菌的海水储存在深色容器中，在8-10°C下储存长达6个月。 如果没有冷藏，请存放在黑暗、阴凉的地方。使用孔径为0.55-1μm的真空过滤系统过滤水。在将所有水拉入之前关闭真空源，以免损坏过滤器，并将过滤后的水倒入专用的无菌容器中。对于较大的体积，请使用流通式过滤系统。例如，让海水流过一系列三个褶皱过滤器（10 μm、5 μm 和 1 μm），从最大到最小的孔径排列。注意：如果无法获得天然海水，可以制备人工海水。或者，天然海水可以从水族箱商店批量购买，并且通常经过过滤、消毒和 pH 平衡。对于这些选项，媒体扩充仍然是必要的。 使用紫外线和/或高压灭菌方法对过滤后的海水进行灭菌。以制造商推荐的流速将流通系统连接到水族箱紫外线灯。将海水高压灭菌在高压灭菌安全的玻璃器皿中，盖子略微打开或用箔纸覆盖，并进行液体循环（121°C;1-2 PSI，15-30分钟，取决于液体的体积34。注意：建议在培养的早期阶段使用高压灭菌过滤的海水。 用营养物质和维生素富集过滤灭菌的海水对 M. pyrifera 的生长至关重要。Provasoli 富集海水培养基 （PES） 是一种广泛使用的培养基，设计用于藻类培养35。从藻类培养中心购买此培养基。用于 M. pyrifera 生长的 PES 和附加维生素的制备方法在34 中描述。每 1 升过滤海水用 20 mL PES 富集。或者，使用工业级培养基。 根据制造商的建议存储浓缩解决方案。当需要生长培养基时，富集过滤灭菌的海水，以避免富集溶液降解。 3. 现场收集 确定孢子叶收集的时间，以模拟当地 M. pyrifera 种群的自然繁殖周期。 咨询当地专家（例如，海带研究人员、管理人员、生态学家、公民科学家、潜水团体），以确保收集孢子叶的适当时间。 获得符合当地法律法规的海带组织采集必要许可。这可能是培养过程中耗时的一部分，必须纳入项目时间表。 通过自给式水下呼吸器（SCUBA）从10-15个可育的 M. pyrifera 个体中选择3-5个孢子叶叶片，具有可见的sori，间隔至少为2 m。如果可能的话，选择干净和完整的孢子叶，几乎没有结垢或降解。从现在开始，根据亲本单独储存孢子叶叶片。注意：孢子叶生长在成鱼海带固定物上方基部的密集“裙子”中，可以通过它们缺乏充满气体的气囊来识别 1.成熟的鼻腔组织通常比周围组织略微隆起，颜色更深1。 将孢子叶叶片在深色收集袋中运输，以避免过度暴露在阳光下，用最少的海水来自现场以保持叶片湿润，并储存在大约 12 °C 的冷却器中，直到到达培养空间。确保样品不与冰直接接触。注意：孢子叶可以运送到其他地方或从其他地方运送。用海水冲洗孢子叶。将从单个 M. pyrifera 个体收集的刀片包裹在浸泡在海水中的湿纸巾中，然后再次浸泡在铝箔中，以避免光线穿透和额外的干燥36.这种储存方法通常被称为“墨西哥卷饼法”。 将这些包装放入装有冰块的冷却器中，并带有保护屏障，例如回收的气泡膜或纸板。准备冷却器以备隔夜运输。确保有人可以接收货件并将包裹放在冷藏条件下。 4. 孢子形成 如果可能，在10-15°C之间的温度受控环境中处理孢子叶，并远离任何其他培养物。提前准备和消毒器械和工作站。处理海带组织时戴上防护手套，以减少污染。 任选地将孢子叶在冷藏条件下储存12-48小时，促进孢子从sorus组织37中释放。要存储，请使用第 3.3 节中描述的“墨西哥卷饼方法”。 选择成熟的 sorus 组织，并使用无菌剪刀将其切成 25 cm2 段。从 10-15 个海带亲本中选择 1-2 个干净的 sori 部分，以促进遗传多样性。注意：如果储存，可以选择在纸巾上找到部分孢子形成的证据，表明存在肥沃的伤口组织。Sorus 组织通常比周围组织略微凸起且颜色更深。 清洁时，仅用无菌纱布向一个方向轻轻擦洗 sorus 组织的两侧amp用过滤消毒的海水。如果需要，用无菌剃须刀片轻轻刮擦 sorus 组织以完全去除污垢。将sori部分浸入淡水浴中30秒至1分钟，然后用过滤消毒的海水冲洗。注意： 在处理来自不同个体的不同 sori 部分时，请刷新淡水浴并对使用的材料进行消毒，以减少交叉污染。 将每个sori部分浸没在无菌50mL离心管中回火至10-15°C的过滤灭菌海水中。将试管置于4-12°C的黑暗中，最多发孢4小时。如果没有冰箱，请将其存放在光线不足、阴凉的地方。注意：或者，sori切片可以在单个无菌容器中孢子。 使用复合显微镜和血细胞计数器，每30分钟观察3-4个样品的孢子密度，最多4小时。在样品之间更换移液器吸头。如果密度至少为 10,000 个孢子 mL-1 （参见 第 5.1.1 节），请继续下一步。如果sori切片在4小时后不产生孢子，则丢弃样品。孢子可以在释放后数小时内沉降，但可以观察到以圆周运动游泳。 用无菌镊子从试管中取出每个sori部分。将所得孢子溶液混合到一个灭菌的容器中，并量化最终的组合密度。 5. 接种 计算接种所需的孢子溶液的最终体积。确保培养容器中的最终浓度约为 500-1,000 个孢子 mL-1 。要根据血细胞计数器中心网格的计数计算合并孢子样品的浓度，请将计数除以 10-4 mL（代表在血细胞计数器中查看的溶液体积）。 要确定要添加到每个容器中的孢子溶液的体积，请确定将底物浸没在培养容器中所需的生长培养基量。 要找到每个容器中的孢子总数，请将该海水体积乘以所需的浓度。 要确定要添加的孢子溶液的总体积，请将孢子总量除以孢子溶液中每毫升的孢子浓度。 将无菌载玻片放入培养容器中以监测海带的发育。包括至少 30 张幻灯片，这些载玻片随机分布在培养容器中，以便进行充分监测（详见 第 7 节）。 使用含有浸没在生长培养基中的底物的无菌移液管吸头将计算体积的孢子溶液接种到培养容器中。关闭容器并轻轻搅拌以分配孢子。密封容器并将其放入培养系统中。 6.饲养条件 根据部署地点的温度将温度设置在 10-15 °C 之间。 1 天后，使用过滤后的气源进行轻度曝气。 将水生植物的全光谱 LED 灯设置为 12 小时光：12 小时黑暗循环，光强度范围在 0-180 μmol 光子 m-2 s-1 之间：从 0-1 天将光强度设置为 5-10 μmol 光子 m-2 s-1 ，并在 20 周结束时增加到 20 – 30 μmol 光子 m-2 s-1 。 从此时开始，每 3-4 天增加 10-20 μmol 光子 m-2 s-1 的辐照度，直到在 6 周结束时达到 180 μmol 光子 m-2 s-1 的辐照度。 继续以180μmol光子m-2s-1培养物直到8周结束时，或者当孢子体长度达到约1-2cm时。 7. 监控 在前两周内，每天/每隔一天监测至少两张随机载玻片以评估发育情况。要进行监测，请用灭菌镊子处理载玻片，并将其放入干净的培养皿中，培养皿中含有足够的灭菌海水以淹没载玻片。取出后不要将载玻片放回培养物中，以免交叉污染。 使用40-400倍放大倍率的复合或倒置显微镜观察早期海带。使用以下时间线跟踪发育（有关发育生活史阶段的示例，请参见图 3）。注意：在0-1天时观察到沉降孢子。孢子可以在几个小时内发芽，如胚管的形成所证明的那样。通常在1-2天观察到发芽。早期配子体通常在1-4天观察到。配子发生是细胞经历分裂和分化以形成雄性和雌性配子的过程，通常在前两周内观察到。雌性细胞比雄性细胞大5-7倍。雄性配子体长出细细的丝状分枝，而雌性则呈圆形或卵形。雌性通常在 2-3 周内产卵或卵子。从雄性释放的精子游向雌性并使卵子受精，导致二倍体受精卵的形成。具有正确的接种密度将确保通过接近38,39成功繁殖。受精卵发育成胚胎孢子体。孢子体通常在 2-4 周内观察到。受精卵经历快速细胞分裂，在大约 6-8 周内生长 1-2 厘米的叶片。 两周后，每周监测至少两张随机载玻片 1-2 次，以确保健康生长和污染，直到孢子体达到 1-2 厘米大小。注意：健康生长的特征是金棕色（而不是绿色或透明）颜色。在倒置显微镜的载玻片上可以观察到几个定量指标，包括存活率、发芽率、营养发育、生殖成熟度和繁殖力以及性别比40。 用显微镜评估细菌、真菌、纤毛酸盐和硅藻的污染。去除分离的污染物。用二氧化锗（GeO2）（见 第8.3节）处理控制硅藻污染的早期迹象。 8. 维护 根据第 6.3 节调整光照条件。 每周更换生长培养基，以补充 M. pyrifera 生长所需的营养和矿物质。将新鲜的生长培养基冷却至适当的温度。在此过程中确保温度不超过 15 °C。 将培养基从培养容器中抽出，以避免干扰接种基质。让介质排空，直到容器几乎为空。立即刷新介质以尽量减少干燥。重新填充生长容器时，稍微倾斜它们，使培养基沿着培养容器的侧面流下，以尽量减少对基质的干扰。 在每周更换培养基期间随机重新排列容器或桶的位置，以考虑光辐照度的差异。注意：请参阅 补充文件 1 以获取跟踪大囊藻培养活动和期望的日历。它指示调整光线和曝气的时间，以及每周的介质变化。 或者，通过二氧化锗（GeO2）处理来控制硅藻污染。向接种基质中每加入 1 L 海水，加入 0.3-0.5 mL 250 mg/mL GeO2，以减少广泛的硅藻污染。注意：GeO2 可能会抑制藻类配子的产生。在萌发后的短窗口内，在卵子和精子产生高峰期之前（1-7天）和/或卵子受精和孢子体观察后（>21天）应用GeO2 处理，然后在48小时后更换培养基以去除化学物质。这些时间表可能因培养条件而异，因此用显微镜监测生命阶段的发育是评估 GeO2 应用时间的最佳方法。如果培养容器中硅藻污染持续存在，并且观察到早期海带过度生长，请考虑重新播种基质。 9. 巨型海带营养配子体培养 全年在营养条件下繁殖配子体培养物，以减少对天然珊瑚礁季节性孢子叶收集的依赖。根据源群体将配子体培养物储存在装有生长培养基的烧瓶中，在4-12°C的红光下，在12光：12暗循环中以5-20μmol光子m-2 s-1 的强度储存。 提供恒定的曝气，每 2-6 个月更换一次介质。 为了增加无性生长的配子体的生物量，用于“绿色砾石”播种，增加通气以悬浮配子体，将培养基更换的频率增加到每周一次，并每两周切割一次配子体。通过摇晃或搅拌将配子体生物质悬浮在培养瓶中，并在必要时用无菌工具刮擦培养瓶的侧面以去除附着的配子体。 将悬浮的配子体倒入无菌搅拌机或咖啡研磨机中，并将配子体溶液脉冲约5-15次，视生物量浓度而定，直到看不到团块。 为了诱导“绿色砾石”播种的繁殖，如上所述，将配子体碎片化。然后，接种底物并将全光谱LED光从5-20增加到45-60μmol光子m-2 s-1 （+10μmol光子m-2 s-1 每天用于光驯化），然后每3-4天增加10-20μmol光子m-2 s-1 ，直到达到180μmol光子m-2 s-1的辐照度。 10. 部署 实验室培养6-8周后，确保幼年孢子体长1-2厘米并准备好部署（图4）。在部署前 24 小时刷新培养箱中的生长培养基。 获得符合当地法律法规的砾石部署必要许可证。这可能是培养过程中耗时的一部分，必须纳入项目时间表。 将“绿色砾石”装在托盘中，上面覆盖着浸泡在海水中的毛巾，以保持海带水分。将托盘放入装有冰块的保温冷却器中，确保它们不与冰直接接触。确保 “绿色砾石” 紧密包装，以避免在运输过程中滚动基质和孢子体分离。注意：根据空间的可用性，基质也可以在其培养容器或桶中运输，以减少处理。 在阴凉的冷却器中运输 “绿色砾石”长达 6 小时。部署时间应避免阳光直射。如果从船上部署，请在部署过程中使用遮荫结构以避免阳光直射。 在新地点和小规模试验时，小心地将 “绿色砾石”从表面撒到下面的珊瑚礁上或通过水肺潜水。