Visualisatie van eiwitten met een lage abundantie en posttranslationele modificaties in levende Drosophila-embryo's via fluorescerende antilichaaminjectie
Summary
Dit protocol beschrijft de op maat gemaakte op antilichamen gebaseerde fluorescentie-etikettering en injectie in vroege Drosophila-embryo’s om live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of posttranslationele modificaties mogelijk te maken die moeilijk te detecteren zijn met behulp van traditionele GFP/mCherry-tag-benaderingen.
Abstract
Visualisatie van eiwitten in levende cellen met behulp van GFP (Green Fluorescent Protein) en andere fluorescerende tags heeft het begrip van eiwitlokalisatie, dynamiek en functie sterk verbeterd. In vergelijking met immunofluorescentie geeft live beeldvorming de lokalisatie van eiwitten nauwkeuriger weer zonder mogelijke artefacten die voortvloeien uit weefselfixatie. Belangrijk is dat live beeldvorming kwantitatieve en temporele karakterisering van eiwitniveaus en lokalisatie mogelijk maakt, cruciaal voor het begrijpen van dynamische biologische processen zoals celbeweging of -deling. Een belangrijke beperking van fluorescerende tagging-benaderingen is echter de noodzaak van voldoende hoge eiwitexpressieniveaus om een succesvolle visualisatie te bereiken. Bijgevolg kunnen veel endogeen gelabelde fluorescerende eiwitten met relatief lage expressieniveaus niet worden gedetecteerd. Aan de andere kant kan ectopische expressie met behulp van virale promotors soms leiden tot verkeerde lokalisatie van eiwitten of functionele veranderingen in fysiologische contexten. Om deze beperkingen aan te pakken, wordt een benadering gepresenteerd die gebruik maakt van zeer gevoelige antilichaam-gemedieerde eiwitdetectie in levende embryo’s, waarbij in wezen immunofluorescentie wordt uitgevoerd zonder de noodzaak van weefselfixatie. Als bewijs van het principe kan de endogeen GFP-gelabelde Notch-receptor die nauwelijks detecteerbaar is in levende embryo’s met succes worden gevisualiseerd na injectie van antilichamen. Bovendien werd deze benadering aangepast om posttranslationele modificaties (PTM’s) in levende embryo’s te visualiseren, waardoor temporele veranderingen in tyrosinefosforyleringspatronen tijdens de vroege embryogenese konden worden gedetecteerd en een nieuwe subpopulatie van fosfotyrosine (p-Tyr) onder apicale membranen kon worden onthuld. Deze aanpak kan worden aangepast om andere eiwitspecifieke, tag-specifieke of PTM-specifieke antilichamen te accommoderen en moet compatibel zijn met andere injectie-ontvankelijke modelorganismen of cellijnen. Dit protocol opent nieuwe mogelijkheden voor live beeldvorming van eiwitten met een lage abundantie of PTM’s die voorheen moeilijk te detecteren waren met behulp van traditionele fluorescerende tagging-methoden.
Introduction
Immunofluorescentie is een hoeksteentechniek van de moderne celbiologie, oorspronkelijk ontwikkeld door Albert Coons, die de detectie van moleculen in hun oorspronkelijke cellulaire compartimenten en karakterisering van de moleculaire samenstellingen van subcellulaire organellen of machinerieën mogelijk maakt. In combinatie met genetische manipulaties helpt immunofluorescentie bij het vestigen van het nu algemeen aanvaarde concept dat eiwitlokalisatie essentieel is voor zijn functie2. Afgezien van specifieke primaire antilichamen en heldere fluorescerende kleurstoffen, is het succes van deze techniek afhankelijk van een voorbereidend proces genaamd fixatie en permeabilisatie, dat cellulaire morfologieën behoudt, antigenen immobiliseert en de toegankelijkheid van antilichamen in intracellulaire compartimenten vergroot. Het is onvermijdelijk dat het fixatie- en permeabilisatieproces cellen zou doden en alle biologische processen zou beëindigen3. Daarom biedt immunofluorescentie alleen momentopnamen van de levensreis van eiwitten. Veel biologische processen, zoals celmigratie en -delingen, zijn echter dynamisch van aard en vereisen onderzoek naar eiwitgedrag op een ruimtelijk-temporeel opgeloste manier 4,5.
Om de eiwitdynamiek in levende organismen te onderzoeken, zijn live beeldvormingsmethoden ontwikkeld op basis van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit (GFP)6 en hogesnelheidsconfocale microscopen. Kortom, het eiwit van belang kan genetisch worden gemanipuleerd om te worden gefuseerd met GFP7 en vervolgens ectopisch tot expressie worden gebracht uit virale of gistpromotors zoals cytomegalovirus (CMV)8 of stroomopwaartse activeringssequentie (UAS)9. Omdat GFP autofluorescerend van aard is, zijn er geen fluorofoorgekoppelde antilichamen nodig om de lokalisatie van doeleiwitten te onthullen, wat de noodzaak van voorbereidende processen van fixatie of permeabilisatie omzeilt. In de afgelopen twee decennia zijn fluorescerende tags ontwikkeld die het hele spectrum van golflengten bestrijken10, waardoor meerkleurige live-beeldvorming van verschillende doeleiwitten tegelijkertijd mogelijk is. In vergelijking met chemisch gemanipuleerde fluorescerende kleurstoffen zoals AlexaFluor of ATTO, is de autofluorescentie van deze genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten echter relatief zwak en onstabiel wanneer ze tot expressie worden gebracht door endogene promotors, vooral tijdens live beeldvorming over langere tijdschalen10. Hoewel dit tekort kan worden verzacht door fluorescerend gelabelde doeleiwitten tot overexpressie te brengen, verstoren veel enzymatische activiteiten zoals kinasen en fosfatasen de normale biologische processen ernstig als ze niet op fysiologisch niveau tot expressie worden gebracht.
Dit protocol presenteert een methode die fototabele, op antilichamen gebaseerde doelverlichting mogelijk maakt in een live-beeldopstelling, waardoor in wezen immunofluorescentie mogelijk is zonder het proces van fixatie of permeabilisatie (Figuur 1). Door middel van een eenvoudige, op NHS gebaseerde primaire aminereactie11 kan men fluorescerende kleurstoffen zoals AlexaFluor 488 of 594 conjugeren met in wezen elk primair antilichaam of GFP/HA/Myc nanobody12. Door gebruik te maken van een ontwikkelingskenmerk dat alle embryonale cellen van Drosophila een gemeenschappelijk cytoplasma delen tijdens het syncytiumstadium13, kan men antigeenbinding en verlichting bereiken over hele embryo’s na de injectie van kleurstofgeconjugeerde antilichamen. Met groeiende bibliotheken van endogeen gelabelde eiwitten die beschikbaar zijn in Drosophila en andere modelsystemen14, kan deze methode mogelijk de toepassingen van deze bibliotheken verbreden door de dynamiek van fluorescerend gelabelde eiwitten met een lage abundantie en andere niet-fluorescerend gelabelde (HA/Myc-gelabelde) eiwitten in levende weefsels te onthullen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze gepresenteerde procedure schetst de gespecialiseerde methode van fluorescentie-etikettering met aangepaste antilichamen en daaropvolgende injectie in Drosophila-embryo’s in een vroeg stadium. Deze techniek vergemakkelijkt real-time visualisatie van eiwitten of posttranslationele modificaties die in kleine hoeveelheden voorkomen en doorgaans moeilijk te observeren zijn via conventionele GFP/mCherry-taggingmethoden.
Voorzichtigheid is geboden bij het uitbreiden van deze methode om …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Jennifer A. Zallen bedanken voor het leveren van de Sqh-GFP Drosophila-lijn en ondersteuning voor de eerste ontwikkeling van deze techniek, en Dr. Francois Schweisguth voor het leveren van de Notch-GFP Drosophila-lijn . Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Natural Science Foundation of China (32270809) aan HHYU, genereuze financiële en personeelssteun van de School of Life Sciences, SUSTech, en financiering aan Y. Yan van de Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Riferimenti
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
