Echtzeit-Hochdurchsatztechnik zur Quantifizierung der Bildung extrazellulärer Neutrophilenfallen in menschlichen Neutrophilen
Summary
Wir präsentieren eine automatisierte Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) unter Verwendung des Lebendzellanalysesystems, gekoppelt mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz.
Abstract
Neutrophile sind Zellen der myeloischen Linie, die einen entscheidenden Teil des angeborenen Immunsystems bilden. Das letzte Jahrzehnt hat zusätzliche Schlüsselrollen aufgezeigt, die Neutrophile bei der Pathogenese von Krebs, Autoimmunerkrankungen und verschiedenen akuten und chronischen Entzündungszuständen spielen, indem sie durch mehrere Mechanismen zur Initiierung und Aufrechterhaltung von Immundysregulation beitragen, einschließlich der Bildung von extrazellulären Fallen (NETs) für Neutrophile, die für die antimikrobielle Abwehr entscheidend sind. Einschränkungen bei den Techniken zur unvoreingenommenen, reproduzierbaren und effizienten Quantifizierung der NET-Bildung haben unsere Fähigkeit eingeschränkt, die Rolle von Neutrophilen bei Gesundheit und Krankheiten besser zu verstehen. Wir beschreiben eine automatisierte Echtzeit-Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung von Neutrophilen, die sich in der NET-Bildung befinden, unter Verwendung einer Lebendzell-Bildgebungsplattform in Verbindung mit einem membranpermeabilitätsabhängigen Dual-Farbstoff-Ansatz unter Verwendung von zwei verschiedenen DNA-Farbstoffen zur Abbildung intrazellulärer und extrazellulärer DNA. Diese Methodik ist in der Lage, die Physiologie von Neutrophilen zu bewerten und Moleküle zu testen, die auf die NET-Bildung abzielen können.
Introduction
Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind netzartige Chromatinstrukturen, die als Reaktion auf verschiedene Entzündungsreize aus Neutrophilen extrudiert werden. NETs bestehen aus DNA, Histonen und verschiedenen antimikrobiellen Proteinen/Peptiden, die infektiöse Krankheitserreger einfangen und abtöten und Entzündungsreaktionen hervorrufen1.
Während NETs für die Wirtsabwehr gegen Krankheitserreger von Vorteil sind, haben sie als potenzieller Treiber verschiedener Autoimmunerkrankungen2, Thrombosen3, Stoffwechselerkrankungen4 und metastasierendem Wachstum von Krebs5 Aufmerksamkeit erregt. Daher ist die Hemmung der NET-Bildung eine potenzielle therapeutische Option für diese Erkrankungen. Trotz einiger vielversprechender NETs-Targeting-Moleküle in der Entwicklung6 gibt es jedoch noch keine zugelassene Therapie, die diesen Mechanismus spezifisch beeinflusst. Dies ist zumindest teilweise auf den Mangel an objektiven, unvoreingenommenen, reproduzierbaren und Hochdurchsatz-Quantifizierungsmethoden für die NET-Bildung zurückzuführen.
Wir haben eine neue Methode unter Verwendung einer zweifarbigen Lebendzell-Bildgebungsplattform etabliert und berichtet 7,8. Zeitrafferbilder von Neutrophilen, die mit membrandurchlässigem Kernfarbstoff und membranundurchlässigem DNA-Farbstoff gefärbt wurden, werden von der Software analysiert, und die Anzahl der prä- und post-NET-bildenden Neutrophilen wird zu mehreren Zeitpunkten gezählt. Da die Integrität der Plasmamembran während der NET-Bildung durch die Regulation von PKCα-vermitteltem Lamin B und CDK4/6-vermittelter Lamin A/C-Zerlegung9 verloren geht, werden NET-bildende Neutrophile mit membranundurchlässigem DNA-Farbstoff gefärbt, gesunde Neutrophile jedoch nicht. Diese Methode überwindet die Probleme zuvor berichteter Techniken zur Quantifizierung der NET-Bildung und bietet eine unvoreingenommene, reproduzierbare und genaue NET-Quantifizierung mit hohem Durchsatz auf automatisierte Weise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aktuelle Methoden zur Quantifizierung von NETs ex vivo haben mehrere Nachteile, die unsere Fähigkeit einschränken, Neutrophile, NETs und potenzielle therapeutische Ziele unvoreingenommen und mit hohem Durchsatz zu untersuchen10,14. Beispielsweise ist die direkte Zählung von NET-bildenden Zellen nach der Immunfluoreszenzfärbung, die als Goldstandard für die Quantifizierung von NETs gilt, mit geringem Durchsatz verbunden und hängt von der subjektiven…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der Abteilung für Lichtbildgebung im Büro für Wissenschaft und Technologie des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health. Diese Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases der National Institutes of Health (ZIA AR041199) unterstützt.
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
Riferimenti
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
