Kryo-Elektronenmikroskopie-Screening-Automatisierung über mehrere Gitter hinweg mit Smart Leginon

Um diesem Protokoll zu folgen, das in Abbildung 2 dargestellt ist, muss Leginon 3.6+ auf dem Mikroskopcomputer und auf einer zusätzlichen Linux-Workstation installiert sein, und Ptolemy muss auf der Linux-Workstation installiert sein. Dieses Protokoll wurde über mehrere Jahre mit Thermo Fisher Scientific (TFS) Glacios- und Krios-Mikroskopen entwickelt. Dieses Protokoll geht davon aus, dass das Lesegerät bereits Leginon, Appion15, die zugehörige Datenbank, Mikroskopkalibrierungen konfiguriert, direkte Ausrichtungen am Mikroskop durchgeführt und zwei Leginon-Anwendungen eingerichtet hat: Eine für die Standard-Einzelpartikelsammlung und eine für die Einzelpartikelsammlung mit Ptolemäus. Informationen zum Aufbau von Leginon finden Sie hier: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Manual. Informationen zur Gründung von Ptolemäus in Leginon finden Sie hier: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Multi-grid_autoscreening. Leginon von http://leginon.org und Ptolemäus von https://github.com/SMLC-NYSBC/ptolemy herunterladen. Leginon ist unter der Apache-Lizenz, Version 2.0, und Ptolemäus ist unter CC BY-NC 4.0 lizenziert. 1. Leginon Verwendung Leginon startenSchließen Sie auf dem Windows-Computer des Mikroskops alle Leginon-Clients und öffnen Sie sie erneut. Öffnen Sie in der Linux-Workstation ein Terminalfenster und geben Sie start-leginon.py oder den entsprechenden Alias des Systems zum Starten von Leginon ein. Wählen Sie im neuen Leginon-Setup-Fenster Neue Sitzung erstellen und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie das Projekt aus der Dropdown-Liste aus und klicken Sie auf Weiter. Lassen Sie den Namen unverändert, wählen Sie den richtigen Halter für die Mikroskopeinrichtung aus und klicken Sie auf Weiter. Geben Sie für die Beschreibung relevante Informationen wie den Namen des Mikroskops, die Raster-/Probenbeschreibung und die Beschreibung des Experiments ein und klicken Sie dann auf Weiter. Stellen Sie für das Image-Verzeichnis sicher, dass das entsprechende Dateisystem ausgewählt ist und dass der vollständige Pfad zum Speichern von Images geeignet ist, und klicken Sie dann auf Weiter. Klicken Sie unter Mit Clients verbinden auf Bearbeiten. Wählen Sie im Dropdown-Menü alle Computer aus, die verbunden werden sollen, klicken Sie auf die Schaltfläche + für jeden Computer und klicken Sie dann auf OK und Weiter. Geben Sie die richtige C2-Blendengröße ein und klicken Sie auf Weiter. Dieser Wert finden Sie auf der Registerkarte Blenden der TFS TUI-Software. Leginon SchnittstelleWählen Sie in der Symbolleiste Anwendung aus, und klicken Sie auf Ausführen. Wählen Sie die richtige Anwendung aus dem Dropdown-Menü aus (klicken Sie bei Bedarf auf Alle anzeigen ). Stellen Sie main auf den Leginon-Computer und das Oszilloskop und die Kamera auf den jeweiligen Computer ein und klicken Sie dann auf Ausführen. Die linke Seite des Leginon-Hauptfensters wird mit Knoten gefüllt.HINWEIS: Im linken Bereich werden alle Leginon-Knoten angezeigt. Die grünen Kamerasymbolknoten sind die Bilder, die gespeichert werden: Raster, Quadrat, Loch und Belichtung. Knoten mit dem Zielzeichen sind Bilder mit geringerer Vergrößerung, um die Bilder mit höherer Vergrößerung anzuvisieren. Die violetten Kameraknoten sind die Knoten, die so programmiert sind, dass sie euzentrische Z-Höhe und euzentrischen Fokus finden. Darüber hinaus gibt es Knoten zum Ausrichten des Null-Verlust-Peaks, zum Überwachen des Pufferzyklus, zum Überwachen der Flüssigstickstofffüllung, zum Sammeln von Verstärkungskorrekturbildern, zum Berechnen der Eisdicke (IceT) und zum Navigieren des Gitters durch verschiedene Vergrößerungen mithilfe von Tisch- und Bildverschiebung. Preset-ManagerKlicken Sie auf den Knoten Presets_Manager. Klicken Sie in diesem Knoten auf das untere Symbol zum Importieren von Voreinstellungen oder auf das Symbol darüber, um eine neue Voreinstellung aus dem aktuellen Zustand des Mikroskops zu erstellen. Wenn Sie auf das untere Symbol klicken, wird ein Fenster “Voreinstellungen importieren” geöffnet. Wählen Sie das richtige TEM und die richtige Digitalkamera aus, klicken Sie dann auf Suchen und wählen Sie die letzte Sitzung mit den gewünschten Voreinstellungen aus. Markieren Sie alle gewünschten Vorgaben und klicken Sie auf Importieren und dann auf Fertig.HINWEIS: Der Knoten Vorgaben-Manager sollte jetzt alle importierten und erstellten Voreinstellungen auflisten. Es wird empfohlen, Voreinstellungen für verschiedene Vergrößerungen und Fokussierungen zu haben, einschließlich gr: Rastervergrößerung, sq: Rechteckvergrößerung, hln: Lochvergrößerung, Lüfter: Autofokus, fcn: Zentralfokus, enn: Belichtungsvergrößerung (nachgestelltes ‘n’ bezieht sich auf Nanosonde). Typische voreingestellte Parameter für jede Vergrößerung sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführt. Beachten Sie, dass dieses Protokoll eine C2-Blendengröße von 70 μm für den Glacios, 50 μm für den Krios mit einem Selectris X und Falcon 4i und 100 μm für den Krios mit einem BioQuantum mit einem K3 verwendet. Navigation und euzentrische HöheUm sich mit der Steuerung des Mikroskops über Leginon vertraut zu machen und die Z-Höhe des Rasters einzustellen, gehen Sie zum Navigationsknoten, wählen Sie oben die gr-Voreinstellung aus und klicken Sie auf den roten Pfeil rechts, um die voreingestellten Einstellungen an das Mikroskop zu senden. Das Mikroskop sollte nach 1-2 s aktualisiert werden. Klicken Sie nach der Aktualisierung auf die Kameraschaltfläche rechts, um ein Bild aufzunehmen. Wählen Sie mit dem Cursor-Werkzeug ein Rasterquadrat aus, um die Bühne zu verschieben. Klicken Sie auf die Quadratvergrößerung und dann auf den roten Pfeil , um ihn an das Mikroskop zu senden, und klicken Sie auf die Kameraschaltfläche , um ein Bild aufzunehmen. Gehen Sie zum Z_Focus Knoten und klicken Sie oben in der Mitte der Schaltflächen auf die Schaltfläche Ziel simulieren . Wechseln Sie während der Aufnahme von Bildern für die Neigungsfokussierung der Bühne in die Korrelationsansicht und beobachten Sie den Peak, um sicherzustellen, dass er sich in der Ecke des Korrelationsbildes befindet. Stellen Sie nach Abschluss der Fokussierung sicher, dass die Bühne auf die Z-Höhe des Rasters eingestellt ist. Koma-KorrekturHINWEIS: In diesem Unterabschnitt wird davon ausgegangen, dass bereits direkte Alignments durchgeführt wurden und dass keine Komakorrekturen durchgeführt wurden.Navigieren Sie zu einem Bereich des Gitters, der klare Thon-Ringe erzeugt, z. B. Kohlenstoffsubstrat.HINWEIS: Ein Kreuzgitter kann verwendet werden, wenn das Sammeln auf einem Goldgitter erfolgen soll. Stellen Sie in den Beam_Tilt_Image Einstellungen sicher, dass die Presets-Reihenfolge nur fcn mit vier Neigungsrichtungen in einem Winkel von 0,005 Bogenmaß enthält. Klicken Sie auf Ziel simulieren , um ein Zemlin-Tableau zu erstellen. Klicken Sie auf der linken Seite des Hauptfensters auf Tableau , um das Tableau anzuzeigen. Korrigieren Sie das Koma, indem Sie die linke und rechte Fourier-Transformation miteinander und die obere und untere Fourier-Transformation miteinander vergleichen. Wenn die Bildpaare nicht identisch sind, klicken Sie zuerst auf das Cursorsymbol rechts neben den Bildanpassungen, klicken Sie dann leicht außerhalb der Mitte des Tableau-Bildes in Richtung der Differenz und warten Sie, bis ein neuer Satz von Fourier-Transformationen gesammelt wurde. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Fourier-Transformationen identisch sind.HINWEIS: Jeder Tableau-Klick dauert einige Sekunden, und während dieser Zeit sollten keine weiteren Klicks getätigt werden. Referenzen gewinnenHINWEIS: Überspringen Sie diesen Abschnitt, wenn die Kamera über automatische Hardwarereferenzen verfügt.Senden Sie im Knoten Navigation eine Voreinstellung mit niedriger Vergrößerung, z. B. gr, und navigieren Sie zu einem Bereich, in dem der Strahlengang nicht behindert wird. Vergewissern Sie sich, dass sich die Tischposition an einer Stelle befindet, die nicht durch den Strahlengang verdeckt wird, indem Sie ein Bild mit mittlerer Vergrößerung mit der Voreinstellung sq oder hln aufnehmen. Senden Sie die Voreinstellung mit hoher Vergrößerung an das Mikroskop. Wählen Sie in den Einstellungen des Korrekturknotens die richtigen Geräteinformationen aus und richten Sie die Kamerakonfiguration so ein, dass sie den Erfassungseinstellungen entspricht. Nehmen Sie ein dunkles Referenzbild auf, indem Sie die Säulenventile am Mikroskop schließen, wählen Sie dann im Knoten Korrektur die Option Dunkel und Beide Kanäle aus den Dropdown-Menüs oben aus und klicken Sie rechts auf die Schaltfläche Kamera erfassen . Wenn Sie fertig sind, wählen Sie Bright aus dem Dropdown-Menü aus und klicken Sie auf Acquire. Leginon öffnet die Säulenventile automatisch. Überprüfen Sie, ob die Verstärkung ordnungsgemäß erfasst wurde, indem Sie im Dropdown-Menü die Option Korrigiert auswählen, auf Erfassen klicken und das resultierende Bild beobachten. Referenzbild der EisdickeWenn das Mikroskop über einen Energiefilter verfügt, aktivieren Sie in den IceT-Knoteneinstellungen die Option Eisdickenbild erfassen, geben Sie 395 für den mittleren freien Weg ein und geben Sie die restlichen Werte für die Einrichtung ein. Wenn das Mikroskop nicht über einen Energiefilter verfügt, senden Sie im Knoten Navigation die enn-Voreinstellung an das Mikroskop und klicken Sie auf Erfassen. Notieren Sie sich den mittleren Pixelwert auf der linken Seite. Aktivieren Sie in den IceT-Knoteneinstellungen die Option Eisdicke aus aperturebegrenzter Streuung berechnen, geben Sie 1055 für den ALS-Koeffizienten und den gemessenen mittleren Pixelwert ein.HINWEIS: Die Werte 395 und 1055 wurden für die TFS Krios bzw. Glacios bestimmt, wie zuvorbeschrieben 16, und müssen möglicherweise für verschiedene Mikroskopkonfigurationen neu kalibriert werden. Kalibrierung der BilddosisWählen Sie im Preset_Manager die enn-Voreinstellung aus und klicken Sie auf die Kameraschaltfläche (Dosisbild für die ausgewählte Voreinstellung erfassen). Überprüfen Sie die gemessene Dosis auf der Unterseite. Wenn er nahe am erwarteten Wert liegt (in der Regel zwischen 30 und 70), klicken Sie auf JA. Voreingestellte AusrichtungenÜberprüfen Sie im Preset_Manager alle Voreinstellungen für die hohe Vergrößerung (enn, fcn und fan), um sicherzustellen, dass die Bildverschiebung und die Strahlverschiebung 0, 0 sind. Navigieren Sie auf dem Mikroskopcomputer zu einem Kohlenstoffbereich. Erfassen Sie auf dem Leginon-Computer im Knoten Navigation ein Bild mit der Voreinstellung gr . Suchen Sie ein Objekt von Interesse und gehen Sie mit dem Cursor-Werkzeug zu diesem Ort. Nehmen Sie ein Bild mit der hln-Voreinstellung auf und verschieben Sie einen eindeutigen Teil dieses Objekts mit dem Cursorwerkzeug in die Mitte. Erfassen Sie ein Bild mit der Voreinstellung enn und verschieben Sie es mit dem Cursor-Werkzeug an denselben eindeutigen Teil des Objekts von Interesse. Wählen Sie Bildverschiebung aus dem Pulldown-Menü und nehmen Sie ein Bild mit der hln-Voreinstellung auf . Verschieben Sie mit dem Cursor-Werkzeug auf denselben eindeutigen Teil des Objekts von Interesse. Wählen Sie im Presets_Manager die hln-Voreinstellung aus, klicken Sie auf dieSchaltfläche s ettings und importieren Sie die Bildverschiebung aus der Navigation , indem Sie auf den linken grünen Pfeil neben den Bildverschiebungswerten klicken. Wiederholen Sie die Schritte 2.9.7 und 2.9.8 für die Voreinstellungen sq und gr . Gitter-AtlasSchließen Sie am Mikroskopcomputer die Säulenventile und ziehen Sie die Objektivblende ein. Wechseln Sie zum Knoten Grid_Targeting. Ändern Sie in den Einstellungen die Beschriftung des Rasters. Wählen Sie den gewünschten Radius des Atlas (der maximale Radius beträgt 0,0009 m). Klicken Sie auf OK. Klicken Sie dann oben auf die Schaltfläche Atlasrechner berechnen und klicken Sie auf die grüne Schaltfläche “Spielen” (“Ziele einreichen”). Im Square_Targeting Knoten werden die Rasterbilder gesammelt und zu einem Atlas zusammengefügt. Vergrößern und verkleinern Sie das Dropdown-Menü und passen Sie Kontrast und Helligkeit an. Verwenden Sie die Bildlaufleisten , um sich durch das Raster zu bewegen. Sobald der Atlas gesammelt ist, setzen Sie die Objektivblende ein , falls gewünscht. Wenn das Mikroskop über einen Energiefilter verfügt, wählen Sie ein Referenzziel in der Mitte eines gebrochenen Quadrats aus, drücken Sie die Play-Taste und fahren Sie mit der ZLP-Ausrichtung im folgenden Unterabschnitt fort. Andernfalls überspringen Sie den ZLP-Ausrichtungsschritt. ZLP-AusrichtungWählen Sie in den Einstellungen des Align_ZLP Knotens die Stufenpositionaus, um das Referenzziel zu verschieben, und wählen Sie den Voreinstellungsmanager als Beweger aus. Deaktivieren Sie den Bypass-Conditioner und drücken Sie dann OK.HINWEIS: Die ZLP-Ausrichtung sollte jetzt so konfiguriert werden, dass sich das Mikroskop regelmäßig zum Referenzziel bewegt und die ZLP-Ausrichtungsroutine der Kamera ausführt. ZLP-Neuausrichtungszeiten von 30 min bzw. 60 min sind für Gatan BioQuantum- bzw. TFS Selectris X-Energiefilter in der Regel sicher. Diese Werte variieren je nach Energiefilterbedingungen, einschließlich konstanter Luftfeuchtigkeit, konstanter Temperatur, elektromagnetischer Feldisolierung und Schwingungsisolierung. Einrichtung der BohrungsschablonenausrichtungWählen Sie im Knoten Square_Targeting mehrere Erfassungsziele aus und drücken Sie dann auf Wiedergabe. Stellen Sie in den Einstellungen des Hole_Targeting Knotens sicher, dass Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen und Ziele in die Warteschlange einreihen aktiviert sind. Überprüfen Sie auch Überspringen Sie vorerst den automatischen Lochfinder . Klicken Sie auf Übernehmen und dann auf OK. Verwenden Sie im Hauptfenster Strg-Umschalt-Rechtsklick , um alle Ziele zu entfernen. Wählen Sie den Erfassungscursor aus und platzieren Sie die Ziele. Wählen Sie den Fokuscursor aus und platzieren Sie ein Fokusziel zwischen den Erfassungszielen. Klicken Sie auf Wiedergabe. Deaktivieren Sie für das nächste Hole_Targeting Bild die Option Automatischen Lochfinder überspringen in den Einstellungen, und klicken Sie dann auf Übernehmen und OK. Entfernen Sie die automatischen Ziele mit Strg-Umschalt-Rechtsklick. Wählen Sie das Linealwerkzeug aus und messen Sie den Durchmesser über eine Bohrung. Ändern Sie in den Schabloneneinstellungen den endgültigen Schablonendurchmesser in den gemessenen Bohrungsdurchmesser. Ändern Sie nicht den ursprünglichen Vorlagendurchmesser. Klicken Sie auf Testen. Wenn sich keine hellen Spitzen in der Mitte jeder Bohrung befinden, erhöhen Sie den endgültigen Schablonendurchmesser. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf OK. Wählen Sie in den Schwellenwerteinstellungen einen Wert für A aus, der die Bohrungen einzeln segmentiert, wenn auf Test geklickt wird. Klicken Sie auf OK , wenn Sie zufrieden sind. Geben Sie in den Blobeinstellungen die Werte ein, und klicken Sie auf Testen. Der Wert für die maximale Anzahl von Blobs ist 1, sodass nur ein Blob angezeigt wird. Klicken Sie auf OK. Verwenden Sie in den Gittereinstellungen das Linealwerkzeug, um den Abstand zwischen zwei Bohrungen (Mitte zu Mitte) zu messen. Geben Sie den Wert in das Feld Abstand ein und klicken Sie auf Testen. Der eine Klecks wird zu einem Gitterpunkt. Klicken Sie auf OK. Gehen Sie zu den Erfassungseinstellungen und optimieren Sie die Erfassungsziele mithilfe von Eisdickenschwellenwerten und der Schaltfläche Zielerfassung testen. Erhalten Sie Informationen zur Eisdicke, indem Sie den Mauszeiger über die Gitterpunkte bewegen. Wenn die Erfassungsziele nicht zufriedenstellend sind, verwenden Sie das Linealwerkzeug , um den Abstand und den Winkel vom Gitterpunkt zur gewünschten Position für ein Erfassungsziel zu messen. Löschen Sie die vorherigen Punkte der Akquisitionszielvorlage. Klicken Sie auf Auto Fill, setzen Sie 4 für die Anzahl der Ziele und ändern Sie den Radius und den Winkel auf die gemessenen Werte. Klicken Sie auf OK. Aktivieren Sie Eisdickenschwellenwert auf schablonengefaltete Erfassungsziele anwenden. Wenn Sie mit den Gitterpunkten und den Eisdickenschwellenwerten zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Ziele senden . Wiederholen Sie einen der obigen Schritte nach Bedarf für jedes ausgewählte Quadrat. Übermitteln Sie die gesamte Warteschlange mit der Schaltfläche Ziele in der Warteschlange senden , sobald alle quadratischen Ziele übermittelt wurden. Leginon beginnt mit der Fokussierung und Abbildung jeder Gruppe von Zielen. Stellen Sie im Z_Focus Knoten sicher, dass die euzentrische Höhe richtig gefunden wird. Einrichtung des Exposure-Vorlagen-TargetingsIm Knoten Belichtungsziel werden Bilder mit Lochvergrößerung angezeigt. Verwenden Sie Strg-Umschalt-Rechtsklick , um die automatischen Ziele zu entfernen. Messen Sie den Durchmesser eines Lochs mit dem Linealwerkzeug. Geben Sie in den Vorlageneinstellungen den Durchmesser in Endgültiger Vorlagendurchmesser ein und klicken Sie auf Testen. Ein Peak sollte sich nun in der Mitte jedes Lochs befinden. Passen Sie die Durchmesserwerte bei Bedarf an. Passen Sie in den Schwellenwerteinstellungen den A-Wert an, bis das binarisierte Testbild nur dort weiße Bereiche anzeigt, wo sich Löcher befinden. Klicken Sie in den Blobs-Einstellungen auf Testen. Ein Blob pro segmentiertem Loch sollte angezeigt werden. Vergrößern Sie den Rahmen , um die Blobs bei Bedarf von den Rändern des Bildes zu entfernen. Klicken Sie in den Gittereinstellungen auf Test. Passen Sie die Parameter an, bis alle Blobs zu Gitterpunkten geworden sind. Klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf das Linealwerkzeug und messen Sie den Abstand zwischen zwei Gitterpunkten. Ändern Sie in den Gittereinstellungen den Abstand auf diesen Abstand. Bewegen Sie den Mauszeiger über jeden Gitterpunkt, um die mittlere Intensität, die mittlere Dicke, die Standardabweichungsintensität und die Standardabweichungsdicke anzuzeigen. Notieren Sie sich die Intensitäten für jeden Gitterpunkt und stellen Sie damit die gewünschten Eisdickenparameter in den Erfassungseinstellungen ein. Messen Sie den Abstand und den Winkel von einem Gitterpunkt bis zur Mitte von 4 Löchern mit dem Linealwerkzeug. Löschen Sie in den Aufnahmeeinstellungen die aktuellen Fokusziele. Klicken Sie auf AutoFill, und ändern Sie den Radius und den Winkel in die gemessenen Werte. Klicken Sie auf Targeting testen, klicken Sie auf OK und dann auf Ziele übermitteln.HINWEIS: Leginon findet den euzentrischen Fokus (Fokusknoten) und sammelt Belichtungen, die im Belichtungsknoten angezeigt werden. Sobald alle Ziele abgebildet sind, wechseln Sie zum Knoten Exposure_Targeting , um das nächste Bohrungsbild anzuzeigen. Deaktivieren Sie in den Einstellungen die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen. Deaktivieren Sie außerdem Ziele in die Warteschlange einreihen und Automatischen Bohrungsfinder überspringen. Klicken Sie auf OK und dann auf Ziele senden.HINWEIS: Leginon sammelt automatisch Bilder basierend auf den oben konfigurierten Einstellungen. Sehen Sie sich die Bilder und Metadaten in Appion an. Änderungen können während der automatisierten Erfassung vorgenommen werden. Ändern Sie beispielsweise jederzeit den Defokussierungsbereich der Sammlung, indem Sie die enn-Voreinstellung im Preset_Manager bearbeiten. Wenn die Sammlung gestoppt werden muss, beenden Sie die Warteschlange, indem Sie auf die Schaltflächen Abbrechen und Warteschlange abbrechen in den Knoten Bohrung und Belichtung klicken. Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, gehen Sie zu Anwendung , klicken Sie auf Beenden, gehen Sie dann zu Datei , und klicken Sie auf Beenden. 2. Smart Leginon Autoscreen Verwendung Erstellen einer Smart Leginon Template-SitzungBefolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 1, um Leginon zu starten. Gehen Sie zu Anwendung und klicken Sie auf Ausführen. Wählen Sie im Fenster Anwendung ausführen die Ptolemäus-Anwendung aus (wählen Sie bei Bedarf Alle anzeigen ). Stellen Sie main auf den Leginon-Computer und das Oszilloskop und die Kamera auf den jeweiligen Computer ein. Importieren Sie im Preset_Manager Voreinstellungen wie in Schritt 1.2.3 beschrieben. Konfigurieren Sie die Knoteneinstellungen.Stellen Sie sicher, dass in den Square_Targeting Knoteneinstellungen die Optionen Ziele nach kürzestem Pfad sortieren und Automatische Zieladressierung aktivieren aktiviert sind (Ergänzende Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass in den Einstellungen für quadratische Knoten die Option Warten auf Knoten zur Verarbeitung des Bildes aktiviert ist. Fügen Sie die Quadrat-Voreinstellung aus dem Dropdown-Menü zur Liste auf der rechten Seite hinzu, falls sie noch nicht vorhanden ist. Aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen die Option Diese Blenden während der Aufnahme einstellen und stellen Sie sicher, dass die Werte für die beiden Blenden korrekt sind (Ergänzende Abbildung 1B). Aktivieren Sie in den Hole_Targeting-Knoteneinstellungen die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen. Deaktivieren Sie Ziele in die Warteschlange einreihen und automatischen Bohrlochfinder überspringen (Ergänzende Abbildung 2A). Aktivieren Sie in der Einstellung Bohrungsknoten die Option Warten, bis ein Knoten das Bild verarbeitet hat, und die Bohrungsvoreinstellung befindet sich in der Liste auf der rechten Seite. Aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen die Option Diese Blenden während der Aufnahme einstellen und stellen Sie sicher, dass die Werte für die beiden Blenden korrekt sind (Ergänzende Abbildung 2B). Aktivieren Sie in den Einstellungen des Exposure_Targeting Knotens die Option Zulassen für die Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele. Deaktivieren Sie Ziele in die Warteschlange und automatischen Bohrlochfinder überspringen (Ergänzende Abbildung 3A). Stellen Sie in den Einstellungen des Belichtungsknotens sicher, dass Warten auf einen Knoten zur Verarbeitung des Bildes deaktiviert ist, die Belichtungsvoreinstellung rechts aufgeführt ist, und aktivieren Sie in den erweiterten Einstellungen die Option Diese Blenden während der Aufnahme einstellen und stellen Sie sicher, dass die Werte für die beiden Blenden korrekt sind (Ergänzende Abbildung 3B). Stellen Sie sicher, dass in den Einstellungen des Fokusknotens die Option Warten auf die Verarbeitung des Bildes durch einen Knoten deaktiviert ist, die Voreinstellung Autofokus auf der rechten Seite aufgeführt ist und die gewünschte Autofokusgenauigkeit auf 4 x 10-6 m eingestellt ist (Ergänzende Abbildung 4A). Aktivieren Sie im Fokusknoten Fokussequenz (neben der Einstellungstaste) nur zwei Strahlneigungs-Autofokusschritte (Ergänzende Abbildung 4B,C). Stellen Sie in den Einstellungen für Z_Focus Knoten sicher, dass die Option Warten auf die Verarbeitung des Bildes durch einen Knoten deaktiviert ist, die Voreinstellung Bohrung auf der rechten Seite aufgeführt ist und die gewünschte Autofokusgenauigkeit 5 x 10-5 m beträgt (Ergänzende Abbildung 5A). Aktivieren Sie im Z_Focus Knoten Fokussequenz nur zwei Neigungsstufen mit geringer Vergrößerung (Ergänzende Abbildung 5B,C). Bestimmen Sie die Z-Höhe des Rasters wie in Schritt 1.2.4 beschrieben. Sammeln Sie einen Atlas wie in Schritt 1.2.10 beschrieben. Richten Sie quadratische Suchparameter ein.Sobald der Atlas eingesammelt wurde, lokalisiert Ptolemäus Quadrate im Square_Targeting Knoten. Jedes Quadrat zeigt einen blauen Kreis, der als Blob bezeichnet wird. Wenn Leginon mit der Maus über jeden Blob fährt, meldet er seine Größe, wie sie von Ptolemäus berechnet wurde. Notieren Sie sich die größten und kleinsten Blobs. Ändern Sie in den Einstellungen für Schwellenwerte den minimalen und maximalen Filterbereich , um erwünschte Quadrate einzuschließen und unerwünschte Quadrate auszuschließen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Quadrate suchen in der oberen Symbolleiste. Passen Sie den Filterbereich an, bis “Quadrate suchen” gut ausgerichtet ist. Wählen Sie in den Akquisitionseinstellungen Werte für Max. Anzahl der Ziele und Anzahl der zu beprobenden Zielgruppe. Diese Parameter definieren, wie viele Quadrate und Gruppen von Quadraten als Ziel verwendet werden. Wenn Sie mit den Parametern zufrieden sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe . Ein Beispiel für einen Atlas nach der Einrichtung ist in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. Richten Sie die Parameter für den Bohrungsfinder ein.Verwenden Sie im Hole_Targeting Knoten das Linealwerkzeug , um den Durchmesser einer Bohrung zu messen. Geben Sie in den Vorlageneinstellungen den Durchmesser in Endgültiger Vorlagendurchmesser ein und klicken Sie auf Testen. Passen Sie den Durchmesser an, bis alle Löcher helle weiße Spitzen in der Mitte haben. Klicken Sie in den Schwellenwerteinstellungen auf Test. Passen Sie den A-Wert an, bis das binarisierte Bild weiße Bereiche nur dort anzeigt, wo sich Löcher befinden. Wählen Sie in den Blobs-Einstellungen aus, dass Rahmenziele ausgeschlossen werden sollen, indem Sie mit dem Lineal einen Mindestabstand von der Kante bestimmen und diesen Wert eingeben. Blobs können nach ihrer Größe, Rundheit und Anzahl gefiltert werden. Bewegen Sie den Mauszeiger über Blobs, um ihre Werte anzuzeigen. Klicken Sie auf Testen , um die aktuellen Werte zu überprüfen. Geben Sie in den Gittereinstellungen den Radius der Löcher und den Abstand zwischen den Löchern ein (verwenden Sie das Messwerkzeug) und klicken Sie dann auf die Schaltfläche 42 , um den Referenzintensitätswert eines Vakuumbereichs (leeres Loch oder gebrochene Stützfolie) zu messen. Aktivieren Sie in den Erfassungseinstellungen die Option Teilmenge der Erfassungsziele verwenden , und legen Sie den Stichprobenmaximalwert auf eine kleine Zahl fest, z. B. 2. Legen Sie einen breiten Bereich von Eisdickenmittelwerten und Standardabweichungen fest (messen Sie diese Werte, indem Sie den Mauszeiger über die Ziele bewegen). Klicken Sie auf Targeting testen , um die Zielauswahl anhand der oben genannten Werte zu randomisieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe , wenn Sie mit allen Einstellungen zufrieden sind. Leginon führt Stufe Z_Focus aus und sammelt das erste Ziel ein. Ein Beispielbild nach der Einrichtung ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Richten Sie Exposure-Targeting-Parameter ein.Stellen Sie in den Locheinstellungen das Shell-Skript auf den hl_finding.sh Skriptpfad in der Ptolemäus-Installation ein. Legen Sie die zu akzeptierende Mindestpunktzahl auf ≤0 fest. Geben Sie den Radius der Löcher ein (verwenden Sie das Messwerkzeug) und klicken Sie dann auf die Schaltfläche 42 , um den Referenzintensitätswert eines Vakuumbereichs (leeres Loch oder gebrochene Stützfolie) zu messen. Klicken Sie auf Testen , um das Gitter der Bohrungen zu finden. Aktivieren Sie in den Erfassungseinstellungen die Option Teilmenge der Erfassungsziele verwenden, und legen Sie den Stichprobenmaximalwert auf eine kleine Zahl fest, z. B. 4, um eine Teilmenge von Bohrungen für das Screening zu sammeln. Legen Sie einen breiten Bereich von Eisdickenmittelwerten und Standardabweichungen fest (messen Sie diese Werte, indem Sie den Mauszeiger über die Ziele bewegen). Klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe , wenn Sie mit allen Einstellungen zufrieden sind. Leginon führt einen euzentrischen Fokus durch und sammelt Bilder mit hoher Vergrößerung, die im Belichtungsknoten zu sehen sind. Ein Beispielbild nach der Einrichtung ist in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt. Überprüfen Sie das nächste Exposure_Targeting Bild, um zu sehen, ob die obigen Einstellungen noch ausreichend sind. Wenn Sie zufrieden sind, deaktivieren Sie die Option Benutzerüberprüfung ausgewählter Ziele zulassen in den Einstellungen für Belichtungs-Targeting und Bohrungs-Targeting.HINWEIS: Die Überprüfung sollte jetzt für das aktuelle Raster unbeaufsichtigt ausgeführt werden. Diese Sitzung wird als Vorlagensitzung für alle Raster verwendet. Sobald das Raster überprüft wurde, klicken Sie auf Datei > Beenden , um Leginon zu schließen. Smart Leginon Autoscreen einrichtenFühren Sie in einem Terminalfenster die autoscreen.py von Smart Leginon aus. Wählen Sie die GUI aus, geben Sie eine durch Kommas getrennte Liste von Raster-Slots für den Bildschirm ein, geben Sie full für den Workflow ein, geben Sie den Namen der Vorlagensitzung ein , auf der neue Sitzungen basieren sollen (diese finden Sie im Appion-Imageviewer), und geben Sie den Z-Höhenwert der Vorlagensitzung ein (Ergänzende Abbildung 9). Es öffnet sich eine GUI, in der Sie den Sitzungsnamen für jedes Raster eingeben und die entsprechenden Projektzuordnungen auswählen können (Ergänzende Abbildung 10).HINWEIS: Smart Leginon Autoscreen verwendet jetzt die Vorlagensitzungseinstellungen, um jedes Raster automatisch zu überprüfen und unbeaufsichtigt zwischen den Rastern zu wechseln. Verfolgen Sie die Sammlung in Leginon, Appion und am Mikroskopcomputer oder lassen Sie das Mikroskop völlig unbeaufsichtigt.HINWEIS: Sobald alle Raster abgeschirmt sind, schließt Smart Leginon die Säulenventile am Mikroskop.