ショウジョウバエにおける糖誘発局所探索行動の追跡

ショウ ジョウバエ(Drosophila melanogaster)カントン-S (CS)野生型株の成虫オスのハエを本研究に使用しました。 1. 実験準備 ハエの飼育12時間以内に出現する成虫のオスのハエを捕集し、標準的なハエ培地(社内で調製)で25°C、相対湿度75%、12時間の明暗サイクルで48時間維持します。注:使用したショウ ジョウバエ 培地組成物は、(培地1 Lに対して)トウモロコシ粉(80 g)、D-グルコース(20 g)、砂糖(40 g)、寒天(8 g)、酵母粉末(15 g)、プロピオン酸(4 mL)、4-ヒドロキシ安息香酸メチル(3 mLのエタノール中1.25 g)、およびオルトリン酸(600 μL)でした( 材料表を参照)。最初の給餌期間は、ハエが飢餓段階の前に十分な餌と栄養素にアクセスできるようにします。オスとメスの両方のハエが探索行動を誘発しますが、飢餓時間はオスのハエの方が一貫しています。さらに、雌のハエは交尾後に摂食の好みを変える11. 飢餓の手順給餌期間の後、ハエの餌を飢えさせますが、水にアクセスできます。注:試行と系統間で飢餓状態を標準化するために、食料飢餓条件下での人口の90%の生存期間を決定することが提案されています。この結果に基づいて、CSバエは概日リズムやその他の要因が検索行動に影響を与える可能性があるため、28時間飢餓状態にあった(図1A)。また、一日のさまざまな時間帯におけるハエの探索活動の概日変化も測定されました(図1B)。その結果、ハエの光期と比較して、夜間の相対的な探索活動が減少することに気づきました。 生後2日のハエから餌を奪うことで、食物飢餓耐性を計算します。底にティッシュペーパーを浸したバイアルに15〜20匹のハエを入れます。これは基質として機能し、ハエが飢餓期間を通して水にアクセスできるようにします。 食物飢餓期間中のハエの数を1時間の一定の間隔で数えます。飢餓状態のハエの90%が生存する期間を飢餓期間として使用しました(図1A)。複数の反復(菌株ごとに3〜4回)を使用して、個々の変動の影響を最小限に抑え、飢餓耐性のより信頼性の高い評価を提供します。注:各菌株の食物飢餓耐性は、異なる菌株と実験の間で標準化された飢餓状態を確立するために決定されました。これらの間隔で生き残ったハエを数えることで、時間の経過とともに生存率を監視し、各株が飢餓に屈するまでの食物欠乏にどれだけの期間耐えられるかを判断できます。 行動を記録する手順飢餓状態の個々のハエを小さなチューブに移します(図2A)。これを5〜6匹のハエのバッチで行い、分離時間を最小限に抑えることができます。1匹のハエをテストし、それぞれのハエを分離することで、観察された変化や行動は、他のハエとの相互作用の影響を受けることなく、観察されている特定のハエに起因する可能性があります。 90 mmシャーレを行動アッセイのアリーナとして使用します(より大きなシャーレを使用できます。大口径のシャーレでは挙動に差はなかった)。表面実装されたクールホワイトLEDのパネルでアリーナを下から照らします(図2B、C)。均一な視覚環境を維持し、外部からの気晴らしを最小限に抑えるために、実験場を白いポリ塩化ビニルパイプ(高さ51.5mm、内径114mm)で囲みます。注:このパイプはバリアとして機能し、アリーナの外からの視覚刺激がハエの行動に影響を与えるのを防ぎます。外部からの気を散らすものを減らすことで、ハエと餌源との相互作用のみに集中し、実験全体を通して一貫性を保つことができます。 アリーナの中央で320ルクスの光強度を使用します。 0.2 μLの糖溶液をアリーナの中央に配置します。報告された実験では500 mMのスクロース溶液が使用されましたが、これは変更することができます。2mLのマイクロ遠心チューブ(内径8.7mm、底に綿を詰めて長さを5mmに減らした。 図2A)シュガードロップの上に逆さまにされた1匹のハエを収容します。 ハエが飛沫を摂取し始めたら、ハエの容器を取り外して、ハエが餌源に無制限にアクセスできるようにします。 オーバーヘッドカメラでアリーナの2D位置を撮影します。注:Flea3(ポイントグレー、1214 mmレンズ、 材料表を参照)を本研究に使用し、40フレーム/秒(fps)で記録しました。ただし、背景とのコントラストが良好なカメラであれば、どれでも使用できます。実験の性質に応じて、30〜60fpsで記録できます。追跡ソフトウェアと互換性があるため、.avi形式で記録します。 ハエがアリーナから逃げ出すまでの裁判を記録します。ハエは自由に歩き回り、アリーナには蓋がありませんでした。 ハエが探すのをやめるか、飛び去るか、アリーナの周辺まで歩くかを判断できるようにすることで、ハエの自然な行動と餌探しの戦略を観察します。試験の合間に70%エタノールでシャーレを拭き取り、完全に乾かすか、新しいシャーレを使用してください。注:ハエが一貫して高い活動レベルを示すライトが点灯してから2時間から6時間の間にすべての実験を行うことが重要です。この時間枠により、ハエが活動状態にあることが保証され、ハエの自然な餌探し行動を観察する可能性が最大化され、概日リズムなど、ハエの行動に影響を与える可能性のある他の要因の影響が軽減されます。行動のセットアップは、温度と湿度が制御された部屋の中に収容されました。アリーナは振動のないテーブルの上に置かれました。この実験では、個々のハエを分離し、糖に対する反応を試験しました。飢餓状態のハエに砂糖を滴し、その行動をビデオで記録しました(図2B、C、ビデオ1)。実験は、ハエが一貫して高い活動レベルを示す特定の時間枠で行われました。 手順 2 に続く軌跡を分析して、検索動作を決定します。 2. 局所探索のための軌跡の解析 Ctraxソフトウェア11 を使用して録画したビデオを分析します( 材料表を参照)。注:ソフトウェアは、ビデオ内のハエの位置を追跡してx、y座標に変換し、その動きの正確な追跡と分析を可能にします。Ctraxの使い方については、 補足ファイル1 を参照してください。 軌跡を初期給餌段階と探索段階の2つの段階に分けます。給餌の終わりと歩行の開始を、3 つの連続したフレームで >4 mm s-1 の速度で移動するハエとして定義します。注:給餌が終わった後、軌道の残りの部分がハエの捜索応答として使用されました。この研究では、VirtualDub( 資料表を参照)を使用して、追跡前のビデオから給餌フェーズを削除しました。 次のパラメーターで検索を定量化します。経路の長さ: このパラメータは、餌の検索中にハエが開始点から歩いた距離(mm単位)を表します。 滞在時間:捜索中にハエが歩いた時間(単位:秒)。これは、検索の期間と、餌を探す際のハエの持続性を示します。 蛇行: パスのビーライン(パスの最初と最後のポイントの間の距離)をパスの全長に除算し、1から減算して比率として計算します。蛇行の値が高いほど、軌跡の曲がりくねりが大きいことを示します。 リターン数:開発されたアルゴリズムを使用して、2つの同心円を使用してリターン数を識別してカウントします。注:内側の円は検索の起点を示すRin (2.5 mm)と外側の円は、フライが原点から離れる必要があった最小距離Rout(4 mm)を示します。リターンは、外側の円(Rout)から出て、内側の円(Rin)に戻ることと定義されました。 活動率:フライの歩行速度が2mm/sを超える餌探しの時間を求め、活動率をパーセンテージで表します。このパラメータは、ハエの活動レベルと餌探しへの関与を反映しています。活動的な採餌者とそうでない個体を区別します。注:本研究では、軌跡のさらなる解析のためにMATLABとPythonを使用しました。スクリプトには、https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search からアクセスできます。分析手順では、Ctraxソフトウェアを使用してハエの動きを追跡し、餌の検索時間、経路の総長、検索時間、蛇行、リターンの回数、活動率などのパラメータを決定します。これらのパラメータは、記録された餌探し実験中のハエの行動と採餌効率に関する貴重な洞察を提供します。