Seguimiento del comportamiento de búsqueda local provocado por el azúcar en Drosophila

Para el presente estudio se utilizaron moscas macho adultas de la cepa silvestre Drosophila melanogaster Canton-S (CS). 1. Preparación experimental Cría de moscasRecolectar moscas macho adultas que emergan dentro de un período de 12 h y mantenerlas en un medio de mosca estándar (preparado en casa) durante 48 h a 25 °C con 75% de humedad relativa en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.NOTA: La composición de medios de Drosophila utilizada fue (para 1 L de medio) harina de maíz (80 g), D-glucosa (20 g), azúcar (40 g), agar (8 g), levadura en polvo (15 g), ácido propiónico (4 mL), 4-hidroxibenzoato de metilo (1,25 g en 3 mL de etanol) y ácido ortofosfórico (600 μL) (ver Tabla de Materiales). El período inicial de alimentación asegura que las moscas tengan acceso a suficiente alimento y nutrientes antes de la fase de inanición. Mientras que tanto las moscas macho como las hembras provocan el comportamiento de búsqueda, el tiempo de inanición es más consistente entre las moscas macho. Además, las moscas hembras cambian su preferencia de alimentación después del apareamiento11. Procedimiento de inaniciónDespués del período de alimentación, prive a las moscas de comida pero con acceso al agua.NOTA: Para estandarizar el estado de hambre en todos los ensayos y cepas, se sugiere determinar la duración del 90% de supervivencia de la población en condiciones de falta de alimentos. Con base en este resultado, las moscas CS fueron hambrientas durante 28 h (Figura 1A) ya que los ritmos circadianos y otros factores pueden afectar el comportamiento de búsqueda12. También se midieron los cambios circadianos de las actividades de búsqueda de moscas en diferentes momentos del día (Figura 1B). Notamos una reducción de la actividad relativa de búsqueda nocturna en comparación con la fase ligera en las moscas. Calcule la tolerancia a la inanición de alimentos privando de alimento a las moscas de dos días de edad. Coloque de 15 a 20 moscas en un frasco con papel de seda empapado en el fondo. Esto sirve como sustrato y asegura que las moscas tengan acceso al agua durante todo el período de inanición. Cuente el número de moscas durante el período de inanición de alimentos a intervalos regulares de 1 h. El período en el que sobrevivió el 90% de las moscas hambrientas se utilizó como período de inanición (Figura 1A). Utilice múltiples réplicas (3-4 para cada cepa) para minimizar el impacto de las variaciones individuales y proporcionar una evaluación más fiable de la tolerancia a la inanición.NOTA: Se determinó la tolerancia a la inanición alimentaria de cada cepa con el fin de establecer un estado de hambre estandarizado entre diferentes cepas y experimentos. Al contar las moscas supervivientes en estos intervalos, se puede controlar la tasa de supervivencia a lo largo del tiempo y determinar cuánto tiempo podría tolerar la privación de alimentos cada cepa antes de sucumbir a la inanición. Procedimiento para registrar el comportamientoTransfiera moscas individuales hambrientas en tubos pequeños (Figura 2A). Haga esto en lotes de 5 a 6 moscas para minimizar el tiempo de aislamiento. Al probar moscas individuales, aislando cada mosca, cualquier cambio o acción observada se puede atribuir a la mosca específica que se observa, en lugar de estar influenciada por interacciones con otras moscas. Utilice placas de Petri de 90 mm como escenario para ensayos de comportamiento (se pueden usar placas de Petri más grandes. No hubo diferencia en el comportamiento en las placas de Petri de mayor diámetro). Ilumine la arena desde la parte inferior con un panel de LED blancos fríos montados en la superficie (Figura 2B, C). Para mantener un entorno visual uniforme y minimizar las distracciones externas, rodee la arena experimental con un tubo de cloruro de polivinilo blanco (51,5 mm de altura, 114 mm de diámetro interior).NOTA: Este tubo actúa como una barrera, evitando que cualquier estímulo visual del exterior de la arena influya en el comportamiento de la mosca. Al reducir las distracciones externas, uno puede concentrarse únicamente en la interacción de la mosca con la fuente de alimento, manteniendo la consistencia durante todo el experimento. Utilice una intensidad de luz de 320 lux en el centro de la arena. Coloque 0,2 μl de solución de azúcar en el centro de la arena. Se utilizó una solución de sacarosa de 500 mM en los experimentos informados, pero esto puede variar. Introducir la mosca en la arena utilizando un tubo de microcentrífuga de 2 ml (diámetro interior 8,7 mm, longitud reducida a 5 mm rellenando algodón en la parte inferior; Figura 2A) albergando una sola mosca invertida sobre la gota de azúcar. Una vez que la mosca comience a ingerir la gota, retira el contenedor para moscas, dándole acceso sin restricciones a la fuente de alimento. Filma la posición 2D de la arena con una cámara cenital.NOTA: Para el presente estudio se utilizó Flea3 (Point Grey, lente de 1214 mm, ver Tabla de Materiales) y se grabó a 40 fotogramas por segundo (fps). Sin embargo, se puede utilizar cualquier cámara que proporcione un buen contraste con el fondo. Se puede grabar a 30-60 fps, dependiendo de la naturaleza del experimento. Graba en formato .avi ya que es compatible con el software de seguimiento. Graba la prueba hasta el momento en que la mosca escapó de la arena. Las moscas caminaban libremente y no había tapa en la arena. Al permitir que la mosca decida cuándo dejar de buscar, volar o caminar hacia la periferia de la arena, observe el comportamiento natural de la mosca y la estrategia de búsqueda de alimento. Limpie las placas de Petri con etanol al 70% entre los ensayos y séquelas por completo o use una nueva placa de Petri.NOTA: Es importante realizar todos los experimentos entre 2 h y 6 h después de que las luces estén encendidas, cuando las moscas exhiben niveles de actividad consistentemente altos. Este período de tiempo asegura que las moscas estén en un estado activo, maximizando las posibilidades de observar su comportamiento natural de búsqueda de alimentos y reduciendo el impacto de otros factores que pueden afectar su comportamiento, como los ritmos circadianos. La configuración conductual se alojó dentro de una habitación con temperatura y humedad controladas. La arena se colocó sobre una mesa libre de vibraciones. Esta configuración experimental implicó aislar y analizar moscas individuales para determinar su respuesta al azúcar. Se proporcionó una gota de azúcar a las moscas hambrientas y su comportamiento se grabó en video (Figura 2B, C, Video 1). Los experimentos se llevaron a cabo durante un período de tiempo específico en el que las moscas exhibieron altos niveles de actividad constantes. Analice las trayectorias siguiendo el paso 2 para determinar el comportamiento de búsqueda. 2. Análisis de trayectorias para búsqueda local Analice los videos grabados con el software Ctrax11 (ver Tabla de Materiales).NOTA: El software rastrea y convierte la posición de la mosca en el video en coordenadas x, y, lo que permite un seguimiento y análisis precisos de sus movimientos. Consulte el Archivo Suplementario 1 para obtener detalles sobre cómo usar Ctrax. Divida las trayectorias en dos fases: la fase inicial de alimentación y la fase de búsqueda. Define el final de la alimentación y el inicio de la marcha como moscas que se mueven a una velocidad >4 mm s-1 en tres fotogramas consecutivos.NOTA: Una vez finalizada la alimentación, el resto de la trayectoria se utilizó como respuesta de búsqueda de las moscas. Este estudio utilizó VirtualDub (ver Tabla de Materiales) para eliminar la fase de alimentación de los videos antes del seguimiento. Cuantifique la búsqueda por los siguientes parámetros:Longitud del camino: Este parámetro representa la distancia recorrida por la mosca desde su punto de partida durante la búsqueda de alimento (en mm). Tiempo de permanencia: El tiempo que pasan las moscas caminando durante la búsqueda (en s). Indica la duración de la búsqueda y la persistencia de la mosca en la búsqueda de alimento. Meandro: Calcule esto como una relación dividiendo la línea recta (la distancia entre el primer y el último punto de la ruta) de la ruta a la longitud total de la ruta y restando de 1. Los valores altos de meandro indican más tortuosidad en la trayectoria. Número de devoluciones: Utilice el algoritmo desarrollado para identificar y contar el número de devoluciones utilizando dos círculos concéntricos.NOTA: Un círculo interior que indica el origen de la búsqueda, Rin (2,5 mm) y el círculo exterior que indica la distancia mínima Rout (4 mm) que la mosca tuvo que alejarse del origen. Un retorno se definió como un movimiento fuera del círculo exterior (Rout) y luego volviendo al círculo interior (Rin). Tasa de actividad: Expresada como porcentaje, calcule la tasa de actividad determinando el tiempo durante la búsqueda de alimentos cuando la velocidad de marcha de la mosca supera los 2 mm/s. Este parámetro refleja el nivel de actividad y participación de la mosca en la búsqueda de alimentos. Distingue a los recolectores activos de los individuos menos activos.NOTA: En el presente estudio se utilizaron MATLAB y Python para un análisis más detallado de las trayectorias. Se puede acceder a los scripts aquí: https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search. El procedimiento de análisis implica el uso del software Ctrax para rastrear los movimientos de la mosca y determinar parámetros como la duración de la búsqueda de alimentos, la longitud total de la ruta, el tiempo de búsqueda, el meandro, el número de retornos y la tasa de actividad. Estos parámetros proporcionan información valiosa sobre el comportamiento de la mosca y la eficiencia de búsqueda de alimento durante los experimentos de búsqueda de alimentos registrados.