主动位置回避 （APA） 测试，一种有效、多功能且可重复的小鼠空间学习任务

所有动物程序均由昆士兰大学动物伦理委员会根据澳大利亚国家健康和医学研究委员会的指南（批准号：QBI/189/15）批准。 1. APA房间布置 注意： APA 设备包括一个高架竞技场，该竞技场带有金属网格地板，由 32 厘米高的透明圆形边界包围。金属棒均匀分布（相距 0.5 厘米），直径为 0.3 厘米。 确保 APA 设备位于安装在天花板上的摄像机框架内。使用市售的动物追踪软件追踪老鼠。 APA 竞技场通常以 1 rpm 的速度旋转，并在旋转竞技场内设置预先指定的 60° 静止冲击区。当鼠标进入冲击区时，发出 0.5 mA（60 Hz，500 ms）的轻度足部冲击。 确保冲击区的位置在测试过程中保持不变，并在实验装置中以电子方式设置。旋转竞技场将鼠标带入冲击区域，除非鼠标主动移动以避开它。 在与旋转平台相同高度的四个不同房间墙壁上放置四个新颖的视觉提示，通常距离竞技场 30-50 厘米。确保提示是中性色，例如黑白符号或打印在 A3 纸上并层压以便于清洁的形状（图 1A）。 确保房间的光强度在 30-70 勒克斯之间。 增加光强度会诱发类似焦虑的行为并减少探索。 在开始之前，打开 Tracker 程序并选择 APA 任务。 在 Tracker 2D 的选项中， 选择实验选项卡 。在这里，确保选择了 Place Avoidance- One Frame- Position Only 。这将允许配置所需的参数。保存配置文件并根据需要进行调整。 在 “实验 ”选项卡的“ 实验时间 ”框中设置实验持续时间。典型的实验持续时间为 600 秒或 10 分钟。 确保已选中 启用计时器 。如上所述，更改计时器区域中的冲击参数。 在“实验”选项卡的“房间框架”区域提供的空间中输入常见的实验详细信息。例如，确保“默认输出文件”名称中填充了日期、简单的实验标识符和测试日期。在名称末尾加上下划线“_”，以允许在实验过程中添加唯一的小鼠ID。 在 Room Frame 区域中还有 Targets 选项卡。单击 “编辑 ”按钮可确保整个竞技场都包含在感兴趣区域中。然后，选择 Arc 以提供冲击目标区域的大小和位置的可调整参数（图1B）。 打开 “跟踪 ”选项卡以调整参数以确保成功跟踪鼠标。对比盒具有深色或浅色选项，以允许深色（例如，C57Bl/6）或浅色（例如，BALB/c）小鼠。这在背景和老鼠之间形成了有效的对比。当使用白化病小鼠品系时，在竞技场下方放置一块黑色塑料，以实现这种对比度（图2）。 设置此区域中的鼠标大小和区域范围。设置这些参数以在竞技场中有效识别鼠标。或者，在按下 From Calibrator 按钮后设置这些选项。 选择 “来自校准器 ”按钮，确保竞技场完全位于感兴趣区域蒙版中。在此选项卡中启动竞技场，以确保当竞技场旋转时，竞技场保持在蒙版中。此选项卡对于选择适当的对比度阈值也至关重要。移动 “阈值 ”窗格中的红线以调整对比度阈值。注意： 图 3A 显示了最佳阈值选择，如鼠标所在的橙色实心区域和蓝色“X”所示。 图 3B 显示了一个较差的阈值，仅显示有斑点的橙色，没有“X”。 使用 “设备 ”选项卡，并使用速度按钮设置竞技场的旋转方向和速度。选择正速度和负速度，代表顺时针和逆时针旋转。在“ 电流源 ”部分中设置冲击强度。小鼠最常见的设置是 1 rpm 旋转和 0.5 mA 冲击。 在“ 电流源 ”选项卡中更改传递冲击的方式或时间。确保选择“当前模式”以 跟踪相关模式。当鼠标进入电击区域时，这将提供电击。 选择 时间 以按照用户设置的时间间隔进行冲击。使用以前录制的轨迹通过选择 “从文件”来震动鼠标。这是为了提供一个轭状对照小鼠，在相同的持续时间和强度下承受相同数量的电击，与空间学习无关。注意：文件输出和窗口选项卡允许将数据和视频文件保存在特定目录中。“文件输出”选项卡中的“从图像”按钮还允许感兴趣的区域捕获要选定的整个竞技场。 退到幕后，开始审判。实验者靠近竞技场的存在和任何不必要的噪音都可能影响动物的表现。 确保在试验期间限制任何噪音和气味，这可能会为鼠标提供另一个线索，影响它们的性能。减少这种情况的例子包括确保一个封闭的医疗废物箱，使用远离嘈杂实验室空间的房间，以及彻底清洁小鼠之间的设备。研究人员可以考虑使用白噪声发生器来掩盖不相关的外部噪声。 在整个行为测试期间，让家庭笼子垫料保持不变，因为这可能会提供新的刺激并影响行为。 为避免昼夜变化，请在每天的固定时间进行测试。 2. 习惯于实验者的操作 在测试前至少 2-3 天每天处理每只小鼠 30 秒至 1 分钟。动物处理可显着减少测试期间的压力和焦虑相关行为。 在习惯和测试期间，使用相同的实验室外套，避免使用强烈的除臭剂、古龙水或香水。 3. 适应APA竞技场（1天） 将鼠标带入前厅或测试室以适应。让鼠标习惯至少 30 分钟。在将小鼠带入适应之前，在前厅或测试室设置光强度。 设置 Tracker 软件。创建特定于实验的文件夹。根据实验范式，每天或试验都有单独的文件夹。如上所述设置实验配置，并保存这些配置以备将来使用。 在开始试用之前，单击“ 文件 ”选项卡打开已保存的配置，然后单击“ 保存 ”符号，在新打开的窗口中添加唯一的鼠标 ID，然后按“ 播放 ”选项卡运行试用。 通过将鼠标暴露在旋转竞技场中 5 分钟而不产生冲击，使鼠标习惯于 APA 设备。 将鼠标从尾巴的底部提起，然后轻轻地将其放在戴手套的手上，将鼠标从家笼中取出。将鼠标运送到 APA 设备，并将其放置在远离冲击区的地方，面向墙壁。 退到幕后，开始审判。 在测试结束时，取出鼠标并返回到家笼子里。 收集所有尿液和粪便，并用 80% （v/v） 乙醇彻底清洁网格。 对所有小鼠重复步骤3.4-3.7。 4. 使用APA的获取培训（1-6天） 将房间照明设置为与居住日相同的条件。 将鼠标带入前厅或测试室，并让它适应至少 30 分钟。 如上所述设置跟踪器软件。 设置试用期的持续时间。 确保电流源已打开并设置（即 0.5 mA）。 将鼠标放在远离冲击区并面向墙壁的竞技场上。 退到窗帘后面，按下 播放 按钮开始审判。监视计算机屏幕上的鼠标，并在需要时进行干预。例如，老鼠没有受到冲击或显得压力过大，过度跳跃或发声就是证明。 在测试结束时，取出鼠标并返回到家笼子里。注意：确保小鼠正在接收冲击并对冲击做出反应。小鼠通过向后退和发声来对电击做出反应。如果不是这种情况，他们可能不会受到冲击。这可能是由于网格上的粪便或由于跟踪不足。因此，如上所述，每次试验后清理网格并优化鼠标跟踪至关重要。 5. 反转获取培训（可选，1-6天） 在反转任务中，将冲击区域重新定位到新位置，通常与前一个位置成 180°。评估小鼠灵活学习新冲击区位置的能力。在反向学习期间，房间提示通常不会改变。 对所有小鼠重复步骤3.4-3.7。 6. 探针试用（可选，1天） 在探针试验中，测量到第一次进入的时间和/或避开冲击区的最长时间。注意：这表示在采集阶段之后内存整合。训练有素的小鼠会避免长时间（>60秒）进入休克区，显示出空间学习的证据。 将房间的光线强度设置为采集培训当天的强度。 在测试室或前厅使小鼠习惯30分钟。 设置 Tracker 软件。 将试验持续时间设置为与先前进行的测试周期相同的时间（例如，10 分钟或 30 分钟，具体取决于试验参数）。 不要为这次试验带来冲击。 将鼠标放在厌恶冲击区的另一侧，面向墙壁。 开始审判，退到幕后。 确保有效跟踪鼠标。 在计算机屏幕上监视鼠标，并在鼠标进入冲击区时停止试验。一些研究人员更喜欢继续试验5分钟，以观察小鼠是否继续返回到休克区。 轻轻地拿起鼠标，然后回到家里的笼子里。 确保收集所有尿液和粪便，并用 80% （v/v） 乙醇彻底清洁网格。 7. 轨迹分析 注意：任务的性能可以通过不同的跟踪软件来实现。以下是如何使用随附的软件来确定 APA 任务期间的性能。在这种情况下，将使用 “跟踪分析 ”程序分析数据。 要分析数据，请打开 Track Analysis 程序，然后从主窗口的下拉菜单中选择 Avoidance 。 单击“ 添加任务 ”，将采集阶段保存的数据文件上传到新窗口中。在“ 组名称”中，创建要分析的组，例如，第 1 天或分析时间。 单击 “输出目录 ”以选择保存分析数据的位置。 通过单击“ 添加文件 ”选项卡并从本地驱动器中选择文件来添加要分析的文件。 通过单击 “设置时间 ”选项卡来设置要分析的时间。这提供了定义将要分析的周期的能力，即 0 到 600 秒。或者，在箱中分析数据，即 60 秒。 添加所有轨迹后，单击 “分析 ”选项卡，然后选择“ 运行分析 ”以分析数据。分析将生成多个文件夹。用于分析的数据将位于 TBLfiles 文件夹中。在电子表格中打开这些数据文件，并使用它们进行进一步分析，即成对比较或重复测量方差分析。注意：该分析还将生成其他文件夹，包括 PS 文件，这些文件将在测试期间对小鼠进行单页描述，显示跟踪图和接收电击的位置。