Détection et quantification des mono-rhamnolipides et des di-rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie environnementale et un pathogène opportuniste très préoccupant en raison de sa production de traits associés à la virulence et de sa forte résistance aux antibiotiques ^1,2. Un métabolite secondaire caractéristique produit par cette bactérie est le biosurfactant RL, qui est produit de manière coordonnée avec plusieurs traits associés à la virulence tels que la phénazine pyocyanine, un antibiotique à activité redox et la protéase élastase³. Les propriétés tensio-actives et émulsifiantes de RL ont été exploitées dans différentes applications industrielles et sont actuellement commercialisées⁴.

La plupart des souches de P. aeruginosa, appartenant aux phylogroupes 1 et 2, produisent deux types de RL : mRL, qui consiste en un fragment de rhamnose lié à un dimère d’acide gras principalement de 10 atomes de carbone, et dRL, qui contient un fragmentaire de rhamnose supplémentaire lié au premier rhamnose⁴ (voir figure 1). Cependant, il a été rapporté que deux phylogroupes mineurs de P. aeruginosa (groupes 3 et 5) ne produisent que^{mRL 5,6}. Les deux types de RL contiennent un mélange de dimères d’acides gras, qui, comme nous l’avons mentionné, sont principalement en C10-C10, mais de plus petites proportions de molécules contenant des dimères en C12-C10, C12-C12 et C10-C12:1 sont également produites. La caractérisation des congénères RL produits par différentes souches à l’aide de la HPLC MS/MS a été rapportée ^7,8. Les méthodes décrites dans ce travail ne peuvent faire la différence entre mRL et dRL mais ne peuvent pas être utilisées pour la caractérisation des congénères RL.

P. aeruginosa et certaines espèces de Burkholderia sont des producteurs naturels de RL⁹, mais la première bactérie est le producteur le plus efficace. Cependant, la LR utilisée commercialement est actuellement produite dans les dérivés de Pseudomonas putida KT2440 exprimant les gènes de P. aeruginosa pour éviter l’utilisation de cet agent pathogène opportuniste^10,11. La détection et la quantification de la LR produite par P. aeruginosa sont d’une grande importance pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des caractères liés à la virulence¹², dans la caractérisation des souches appartenant aux clades 3 ou 5¹³, et pour la construction de dérivés de P. aeruginosa qui surproduisent ces biosurfactants tout en ayant une virulence réduite¹⁴. La production de biosurfactants par différents micro-organismes a été détectée sur la base de certaines caractéristiques générales de ces composés, telles que la méthode de la goutte d’effondrement ou l’indice d’émulsification¹⁵, mais ces méthodes ne sont ni précises ni spécifiques¹⁶.

Ici, nous décrivons le protocole de détection des mRL et dRL en utilisant l’extraction liquide des RL totaux des surnageants de culture de différentes souches de type P. aeruginosa et la séparation des deux types de RL à l’aide de la TLC. Dans cette méthode, le RL extrait du surnageant de culture est séparé par sa solubilité différentielle dans les solvants utilisés pour la CCM, provoquant une migration différentielle sur la plaque de gel de silice. Ainsi, les mRL ont une migration plus rapide que les dRL, et ils peuvent être détectés comme des points séparés lorsque les plaques sont séchées et colorées avec du α-naphtol.

La méthode décrite ici pour détecter mRL et dRL par TLC est basée sur un article¹⁷ précédemment publié, qui est facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Cette méthode s’est avérée utile pour détecter le RL dans divers isolats de P. aeruginosa ¹³ à l’aide de témoins appropriés, tels qu’un mutant dérivé de P. aeruginosa incapable de produire un RL. Cependant, ce n’est pas la méthode privilégiée pour caractériser les nouveaux biosurfactants produits par des bactéries autres que Pseudomonas aeruginosa en raison de son manque de spécificité.

De plus, une méthode de quantification des équivalents de rhamnose de la LR totale extraite d’un surnageant de culture de P. aeruginosa est présentée. Cette méthode quantifie ces biosurfactants en fonction de la réaction de l’orcinol avec les sucres réducteurs, ce qui permet d’obtenir un produit qui peut être mesuré par spectrophotométrie à 421 nm, comme décrit précédemment¹⁸. Étant donné que la réaction avec l’orcinol n’est pas spécifique au rhamnose, il est important d’effectuer cette méthode avec le RL extrait du surnageant de culture qui ne contient pas de quantités significatives d’autres molécules contenant du sucre, telles que les lipopolysaccharides (LPS). Un mélange chloroforme/méthanol acidifié est utilisé ici pour l’extraction liquide du RL¹⁸, mais l’acétate d’éthyle peut également être utilisé, et l’extraction en phase solide (SPE) donne de très bons résultats¹⁹. La méthode orcinol décrite ici ne nécessite pas d’équipement sophistiqué et peut fournir des résultats fiables si elle est effectuée avec un soin particulier dans la préparation des échantillons analysés, comme nous l’avons vu. Pour assurer une bonne préparation de l’échantillon, il est important d’inclure un mutant de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapable de produire RL²⁰ et d’effectuer trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques pour chaque détermination.

Il y a eu une controverse importante dans la littérature^16,21 concernant la détermination de la RL par la méthode de l’orcinol, certaines études suggérant que la production de RL est surestimée et que le test manque de spécificité pour le rhamnose, ce qui pourrait permettre de détecter d’autres sucres. Cependant, nous démontrons ici que les méthodes décrites peuvent être précises et spécifiques dans des conditions appropriées. De plus, à des fins de comparaison avec les procédures décrites dans cet article, nous utilisons la détection UPLC-MS/MS d’un étalon dRL et démontrons que des résultats similaires sont obtenus avec la méthode orcinol. Le protocole détaillé de quantification de l’apprentissage par renforcement à l’aide de cette méthode est inclus dans le fichier supplémentaire 1.

Ces protocoles sont illustrés à l’aide des souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3). Ces souches ont été choisies parce qu’elles sont bien caractérisées et produisent différents profils RL.