JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Moleküler Analizler için İnsan Sulu ve Vitröz Sıvı Biyopsilerinin Biyobankacılığı

Published: September 11, 2023
doi:
10.3791/65804
, , , , , , , , , , ,
1Molecular Surgery Laboratory,Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Byers Eye Institute,Stanford University, 3Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences,University of Minnesota, 4Retina Consultants of Minnesota, 5Department of Pediatrics,University of Iowa, 6Department of Neurology,University of Iowa, 7The Iowa Neuroscience Institute (INI),University of Iowa, 8Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 9Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 10Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Summary

Bu protokol, proteomik, metabolomik ve glikomikler dahil olmak üzere moleküler aşağı akış analizleri için yüksek kaliteli insan sulu mizah ve vitreus sıvı biyopsilerinin standartlaştırılmış toplanması, ek açıklama ve biyobankacılığı için entegre bir biyodepo platformu sunmaktadır.

Abstract

Translasyonel araştırmalarda kritik bir zorluk, ameliyathanedeki hasta bakımı (OR) ile araştırma laboratuvarı arasında uygulanabilir ve verimli bir arayüz oluşturmaktır. Burada, göz ameliyatı geçiren hastalardan sulu mizah ve vitreustan moleküler analizler için yüksek kaliteli sıvı biyopsiler elde etmek için bir protokol geliştirdik. Bu iş akışında, insan biyolojik örneklerini elde etmek ve arşivlemek için bilgisayar, barkod tarayıcı ve yerleşik soğuk hava deposu da dahil olmak üzere laboratuvar cihazlarıyla donatılmış bir Mobil Ameliyathane Laboratuvar Arabirimi (MORLI) arabası kullanılır. Web tabanlı veri gizliliği uyumlu bir veritabanı, her numuneye kullanım ömrü boyunca açıklama eklemeyi sağlar ve bir kartezyen koordinat sistemi, depodaki her barkodlu numunenin izlenmesine olanak tanıyarak aşağı akış analizleri için numunelerin hızlı ve doğru bir şekilde alınmasını sağlar. İnsan doku örneklerinin moleküler karakterizasyonu sadece bir tanı aracı olarak hizmet etmekle kalmaz (örneğin, enfeksiyöz endoftalmit ile diğer enfeksiyöz olmayan göz içi inflamasyonunu ayırt etmek için), aynı zamanda yeni ilaç hedeflerinin tanımlanmasına, yeni tanı araçlarının geliştirilmesine ve kişiselleştirilmiş terapötiklere izin veren translasyonel araştırmanın önemli bir bileşenini temsil eder.

Introduction

İnsan gözünden sıvı biyopsilerin moleküler profillemesi, DNA, RNA, proteinler, glikanlar ve son derece uzmanlaşmış oküler dokulardan metabolitler gibi moleküller içeren lokal olarak zenginleştirilmiş sıvıları yakalayabilir. İnsan gözünün arka kamarasındaki vitreustan yapılan sıvı biyopsilerin genel olarak güvenli bir prosedür olduğu kanıtlanmıştır1. Canlı insanlarda oküler hastalıkların moleküler karakterizasyonuna izin verir ve yeni tanı ve tedavi stratejilerini belirleme potansiyeli sunar2,3,4. Gözün ön kamarasındaki sulu mizah daha da yüksek cerrahi erişilebilirliğe sahiptir ve örneğin en sık yapılan ameliyatlardan biri olan katarakt ameliyatı sırasında çok sayıda elde edilebilir. Bununla birlikte, proteomik, metabolomik ve glikomikler de dahil olmak üzere moleküler aşağı akış analizleri için insan sulu mizah ve vitreus sıvı biyopsilerinin toplanması, açıklanması ve biyobankacılığı için standartlaştırılmış bir protokol şu ana kadar mevcut değildir.

Burada, göz ameliyatı geçiren hastalardan moleküler analizler için yüksek kaliteli sıvı biyopsilerin toplanması ve biyobankacılığı için bir protokol geliştirdik. Mobil Ameliyathane Laboratuvar Arayüzü (MORLI), bir araştırmacının toplanan numuneleri ameliyathanede (OR) -80 ° C’de kuru buz üzerinde barkodlu kriyoviyallerde derhal dondurmasını sağlar. Bu prosedür, çıkış yönündeki moleküler analiz için yüksek ve tutarlı bir numune kalitesi sağlar. Mükemmel numune kalitesine ek olarak, bir biyobankadaki numunelerin doğru şekilde açıklanması kritik öneme sahiptir. Web tabanlı HIPAA (Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası) uyumlu REDCap (araştırma elektronik veri yakalama) veritabanı5’i kullanan iş akışımız, yaş, cinsiyet, hastalık, hastalık evresi, numune türü ve ameliyatın benzersiz özellikleri dahil olmak üzere her numune için ayrıntılı meta verilerin depolanmasına olanak tanır. Bu, örneğin belirli bir hastalıktan veya belirli bir hasta grubundan alınan örnekler için doğru gelecekteki arama kapasitesine izin verecektir. Ek olarak, dondurucudaki her numunenin tam konumu, aşağı akış deneyleri için verimli numune alımı sağlayan bir kartezyen ızgara sistemi kullanılarak arşivlenir. DNA, protein, glikan ve metabolit analizlerinin örneklerini gösteriyoruz.

İş akışımız, ameliyathane ile araştırma laboratuvarı arasında pratik ve etkili bir bağlantıyı temsil eder ve çeviri araştırması için değerli bir temel sağlar.

Protocol

Protokol, ABD’deki Stanford Üniversitesi’ndeki İnsan Denekleri Araştırmaları Kurumsal İnceleme Kurulu’nun (IRB) yönergelerini takip etmektedir. DİKKAT: Bu protokol nitelikli oftalmik cerrahlar için bir kılavuzdur. Göz içi maligniteler bağlamında, sulu mizah veya vitreus sıvı biyopsileri ortamında ekstraoküler tümör tohumlaması göz ardı edilemez. Bununla birlikte, transvitreal koroidal tümör biyopsisinde ekstraoküler ekstansiyon ve orbital tutulum riski son derece düşüktür, bu da güvenliği arttırılmış bir şekilde ve giriş yeri dikkatli bir şekilde yapılır6. Bu protokol retinoblastom veya yüksek metastatik riskli tümörleri kapsamaz ve kontrendike olabilir. 1. Numune toplamadan önce Kurumsal inceleme kurulu onayı Deneyin başlamasından önce yerel IRB’den onayları alın ve buna göre numune toplama işlemi gerçekleştirin. Çalışma popülasyonu Dahil etme kriterleri: Hastanın durumunu değerlendirmek için uygun tanı testleri için gerekli olandan fazla miktarda sulu mizah veya vitreus sıvısı sağlayacak kurumda göz içi ameliyatı geçiren tüm hastaları (0-99 yaş arası) ve katılmak isteyen hastaları dahil edin. Dışlama kriterleri: Katılmayı reddeden hastaları ve hamile kadınları hariç tutun. Bilgilendirilmiş onam IRB onaylı protokolü takiben her hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alın. İmzalanan onayı güvenli bir veritabanında arşivleyin. Bu protokolde açıklandığı gibi ilgili personeli (cerrahlar, laboratuvar teknisyenleri, ameliyathane (OR) personeli, bilim adamları) eğitin. Örnek bir yönetim veritabanı ayarlayın. REDCap’i, araştırma çalışmaları5 için veri yakalamayı desteklemek üzere tasarlanmış, HIPAA uyumlu web tabanlı bir örnek veritabanı olarak kullanın.NOT: Bu makalede, kapsamlı programlama bilgisine gerek kalmadan form tasarlamak, alanları tanımlamak, dallanma mantığını ayarlamak ve veri doğrulama kurallarını uygulamak için REDCap tarafından sağlanan web tabanlı arabirimin kullanımı açıklanmaktadır. Alternatif olarak, standart elektronik tablo uygulamaları gibi diğer yazılımlar da uygun olabilir. Bir soğutma kutusunun, kuru buzun, numune toplama için şırınganın ve kriyoviyallerin bulunduğundan emin olun (bkz. Şişelere kalıcı olarak kazınmış barkodlu kriyovyaller kullanın. Bu, şişeye hasta tanımlayıcıları ekleme ihtiyacını ve donma koşulları altında bir etiketi kaybetme olasılığını ortadan kaldırır. Cerrahı vaka hakkında bilgilendirin ve planlanan ameliyattan en az 24 saat önce ameliyathanede numune toplanmasına yardımcı olacak laboratuvar teknisyenini bilgilendirin. 2. Ameliyathanede cerrahi örneklerin alınması Mobil ameliyathane laboratuvar arayüzü (MORLI) Ameliyathanede bir MORLI kurun. MORLI, düz bir laboratuvar tezgah yüzeyi, REDCap veritabanına erişimi olan bir barkod tarayıcıya sahip bir bilgisayar/tablet ve kuru buzlu bir soğutma kutusu içerir (bkz.DİKKAT: Kuru buz aşırı soğuktur. Kuru buzu tutarken daima eldiven giyin ve dokunmaktan kaçının. Ameliyathanede numune toplamanın hazırlanması MORLI’de bilgisayara/tablete giriş yapın ve REDCap veritabanını açın. Bilgilendirilmiş onamın hasta tarafından imzalandığını kontrol edin ve bunu cerrahla onaylayın. Seyreltilmemiş bir numunenin gerekli olduğunu hatırlatın. Eldiven giyin. Uygun sayıda barkodlu kriyoviyal (sulu mizah için 0,5 mL ve vitreus numuneleri için 1,9 mL) elde edin ve bunları kolayca erişilebilecek yerlere yerleştirin. Sulu mizah sıvı biyopsilerinin toplanmasıDİKKAT: İnsan dokusu numunelerini, ilgili personelin güvenliğini sağlamak için laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun önlemleri gerektiren biyolojik tehlikeli maddeler olarak düşünün.NOT: Aşağıdaki adımlar sadece eğitimli bir göz cerrahı tarafından gerçekleştirilmelidir. Sulu mizah sıvı biyopsileri, örneğin, dünya çapında en sık yapılan ameliyatlardan biri olan katarakt ameliyatının başlangıcında elde edilebilir.NOT: Ameliyathanede standart bakım protokollerine göre steril bir alan tutulur. Hasta anestezisi ile ilgili preoperatif işlemler ön kamara ve vitreoretinal ameliyatlarda standart bakım basamaklarını takip etmektedir.Gözü ameliyat için hazırlayın ve örtün ve steril alanın optimum şekilde görselleştirilmesi için steril bir kapak spekulumu yerleştirin. 1 mL’lik bir şırıngaya bağlı 30-32 G iğne kullanarak limbusa dik bir ön kamara parasentezi gerçekleştirmek için bir ameliyat mikroskobu kullanın. Bu işlem sırasında gözü stabilize etmek için bir pamuk ucu veya küçük forseps kullanın.NOT: İğnenin ve şırınganın kilitli olduğundan ve şırıngada basınç olmadığından emin olun (pistonu hareket ettirerek). Göz içi yapılara zarar vermemek için iğnenin ucunun orta ön odadaki periferik iris üzerinde kaldığından emin olun. Katarakt ameliyatında, sıvı biyopsi almak için iğne, katarakt ameliyatı için oluşturulan parasentezlerden biri aracılığıyla ön kamaraya da girebilir. Mikroskop aracılığıyla doğrudan görselleştirme altında, 1 mL’lik bir şırınga kullanarak yaklaşık 100 μL seyreltilmemiş sulu mizahı manuel olarak aspire edin. Şırınga pistonunu cerrahın baskın olmayan eliyle veya iğneyi hareket ettirmeden eğitimli bir asistan tarafından hareket ettirin.NOT: Ön kamaranın çökmesi durumunda 100 μL’den az sulu mizah elde edin. İğneyi ön odadan dikkatlice çıkarın.NOT: Fakik bir gözde, lense dokunmamak için iğneyi irisin üzerinde tutun. Dünya üzerindeki pozitif baskı reflüyü artırabilir. İğne çekilmeden önce pamuk ucunun serbest bırakılması reflüyü azaltmaya yardımcı olur. Pistonu geri çekin ve havanın ve toplanan sıvının nasıl hareket ettiğini görün. Şırıngayı kriyoviyal içine enjekte edin. Ekstra hava, şırınganın ölü alanını temizler. Numuneyi ameliyathanedeki bir bilgisayarda REDCap formuna taramak için kriyoviyal üzerindeki barkodu kullanın (3.1 ila 3.9 arasındaki adımlarda daha fazla ayrıntı). Kriyoviyal derhal soğutma kutusundaki kuru buza aktarın. Hasta için planlanan ameliyata devam edin (örneğin, daha önce tarif edildiği gibi bir katarakt ameliyatı7 ). Vitröz sıvı biyopsilerinin toplanmasıNOT: Aşağıdaki adımlar sadece eğitimli bir vitreoretinal cerrah tarafından gerçekleştirilmelidir. Vitröz sıvı biyopsileri vitrektomi8 başlangıcında elde edilebilir. Amaç seyreltilmemiş bir vitreus örneği toplamak olduğundan, vitrektomi kesicisi sıvı1 ile astarlanmayacaktır.NOT: Ameliyathanede standart bakım protokollerine göre steril bir alan tutulur. Hasta anestezisi ile ilgili preoperatif işlemler ön kamara ve vitreoretinal ameliyatlarda standart bakım basamaklarını takip etmektedir.Gözü ameliyat için hazırlayın ve örtün ve steril alanın optimum şekilde görselleştirilmesi için steril bir kapak spekulumu yerleştirin. Standart bakım prosedürlerini izleyerek 23, 25 veya 27 G trokar kanülü ile sklerotomileri oluşturun. İnfüzyon kanülünü yerleştirin ve vitreus boşluğuna uygun yerleşimi görsel olarak onaylayın. Vitröz boşlukta, seyreltilmemiş bir vitreus örneği toplamak için vitreus kesiciyi infüzyon olmadan aktive edin. Vitröz ekstrüzyon kanülü 1’e bağlı bir şırınga kullanarak 0,5 ila1,0 mL vitreusu manuel olarak aspire edin. Vitröz kesiciyi gözden çıkarın ve sıvı infüzyonunu açın. Boru içinde kalan sıvıyı şırıngaya aspire edin. Şırınganın bağlantısını kesin. Numuneyi, bölüm 2.3’teki sulu mizah örneği için açıklandığı şekilde işleyin (adım 2.3.5 ila adım 2.3.9). 3. Ameliyathanedeki örneklerin işlenmesi ve veritabanına örnek eklenmesi Laboratuvar teknisyeninden hazırlanan kriyoviyal (sulu mizah için 0.5 mL ve vitreus numuneleri için 1.9 mL) almasını ve herhangi bir steril ameliyathane ekipmanına dokunmadan cerraha yürümesini isteyin. Laboratuvar teknisyeninden kriyoviyal açmasını isteyin. Şırıngayı doğrudan kriyoviyal içine boşaltın. Laboratuvar teknisyeninden kriyoviyal derhal özetlemesini isteyin. Laboratuvar teknisyeninden MORLI’ye geri dönmesini ve numuneyi derhal soğutma kutusundaki (-80 ° C) kuru buza aktarmasını isteyin. Kutunun kapağını kapatın. Yeni bir örnek toplama formu açın. Formun ilgili alanına aşağıdaki bilgileri girin: vaka cerrahı, toplanma yeri ve tarihi, hasta tanımlayıcı numarası ve yaş, cinsiyet, sağ veya sol göz, tanı, ameliyat öncesi öykü (serbest metin), prosedürle ilgili bilgiler (örneğin, ameliyat türü) ve toplanan örneklerin sayısı gibi örneklerle ilgili bilgiler gibi diğer temel bilgiler, numune türleri (sulu mizah, vitreus) ve hacimler gibi diğer detaylar. Barkod tarayıcıyı kullanarak tüp barkodunu ekleyin. Gönder/İleri’ye tıklayın. Herhangi bir ek örnek toplanırsa 3.1 ile 3.7 arasındaki adımları yineleyin. Tüm örneklerin güvenliği sağlandığında, REDCap örnek toplama formunda Kaydet ve gönder’e tıklayın. Ardından veritabanından ve bilgisayardan/tabletten çıkış yapın. 4. Kriyoviyallerin depolamaya aktarılması Numuneleri soğutma kutusundaki kuru buz üzerinde ameliyathaneden laboratuvara taşıyın ve laboratuvar bilgisayarının yanındaki laboratuvar tezgahına yerleştirin. Oturum açma kimliğinizi ve parolanızı kullanarak laboratuvar bilgisayarında REDCap’te oturum açın. Eldiven giyin. Toplanan örneklerden birini alın ve kriyoviyalin barkodunu veritabanına tarayın (bölüm 5’te daha fazla ayrıntı). Numuneyi hemen tekrar kuru buz üzerine yerleştirin. Kuru buzla doldurulmuş ikinci bir kap elde edin. Kriyovyaller için -80 °C dondurucudan bir raf alın. İkinci kaba kuru buz üzerine yerleştirin.NOT: 0,5 mL sulu mizah tüpleri için 96 formatlı bir raf ve 1,9 mL vitreus tüpleri için 48 formatlı bir raf gerekecektir. Rafın barkodunu veritabanına tarayın (bölüm 5’te daha fazla ayrıntı). Numuneyi rafa aktarın. Raftaki şişelerin konumunu veritabanına ekleyin (bölüm 5’te daha fazla ayrıntı). Kaydet ve gönder’i tıklayın. Rafı kuru buz üzerindeki şişelerle birlikte -80 ° C’de saklamak üzere buzdolabına taşıyın. Bir koordinat sistemi kullanarak rafı buzdolabında belirli bir konuma ekleyin. Bu daha sonra aşağı akış analizi için numunelerin kolayca alınmasına izin verecektir. 5. Örnek depolama formu Giriş formu aşamasında toplanan her numune için bir depolama formu doldurun. Yeni bir depolama formu oluşturmak ve açmak için boş daireye veya Örnek Depolama altındaki “+” işaretine tıklayın. Kayıt Arşivleme Tarihi altına bu formun doldurulduğu tarihi girin. Numune Tüp Barkodu altında tüp barkodunu tarayın veya yazın. Numuneyi hemen tekrar kuru buz üzerine yerleştirin. Bir numunenin dışarı aktarılıp aktarılmayacağını veya numunenin dahili biyodepo deposuna gidip gitmediğini seçin. Hastadan yazılı bilgilendirilmiş onam alındığını doğrulayın ve Onay Uyumluluğunu Doğrula altındaki kutuyu işaretleyin ve Onaylayan tarafından doğrulandı altına adınızı girin. Raftaki kriyoviyal için ücretsiz ve uygun bir yer seçin. Kriyoviyal bu pozisyonda rafa aktarın (örneğin, A1 konumu). Rafı kuru buz üzerinde tutun. Konum aşamasında, aşağıdaki bilgileri girin: dondurucunun Dondurucu altındaki konumu, numunenin Raf altında saklanacağı raf numarası, Kutu Barkod altındaki kutu barkodu, kutudaki tüp konumu satır (Tüp Konumu (Satır)) ve sütun (Tüp Konumu (Sütun)).NOT: İsteğe bağlı olarak, kutunun dondurucuda bulunmasını kolaylaştırabilecek Kutu Etiketi altına bir kutu etiketi de girilebilir. Kullanım bölümünün altına aşağıdaki bilgileri girin: örneğin kullanıldığı projenin adı (Proje Adı), aşağıdaki kategorilerden birinde bulunan örnek birimi: tam, kısmi, neredeyse boş veya boş (Örnek Birimi) ve varsa Depolama Notları altında depolama notları.NOT: Forma en son erişen tarih, saat ve kullanıcı, gerektiğinde gözden geçirilebilecek ve denetlenebilecek bir gözetim zinciri sağlamak için otomatik olarak doldurulur. Tamamla?’nın altındaki Tamamla’yı tıklatarak formun tamamlandığını onaylayın. Kaydet ve Çık Formu’nu tıklatın. Bu sizi hastaya genel bakışa geri getirecektir. Toplanan her tüp için, Numune Depolama altındaki “+” işaretine tıklayarak başka bir numune toplama formu oluşturun. Ardından 5.1 ile 5.10 arasındaki adımları yineleyin. Formu doldurmak ve veritabanından ve bilgisayardan/tabletten çıkış yapmak için Kaydet ve Çık’ı tıklatın. Numune rafını (kuru buz üzerinde) önceden belirlenmiş konumda buzdolabına aktarın. 6. Aşağı akış analizi için cerrahi örneklerin alınması NOT: Örnekler genellikle analiz edilmeden önce birkaç yıl boyunca arşivlenir. Barkodlu kriyovyaller ve aranabilir REDCap veritabanı sistemi, aşağı akış analizi için her bir numunenin kolayca bulunmasına ve bulunmasına olanak tanır. Veritabanının arama işlevini kullanarak deneme için ilgilenilen örnekleri tanımlayın. Bu, örneğin, diyabetik retinopatisi olan 20 ila 40 yaş arasındaki hastalardan alınan tüm sulu mizah örneklerinin bulunmasına izin verecektir. İlgilenilen kriyoviyallerin yerini öğrenin (dondurucu, raf / raf, numune rafı, raf içindeki koordinatlar). Dondurucudaki numunelerin bulunmasını kolaylaştırmak için bunları bir yere yazın, yazdırın veya bir mobil bilgisayarda/tablette hazır bulundurun. Örnekleri veritabanında kullanıldığı gibi işaretleyin. Formu doldurmak ve REDCap ile bilgisayar/tablet oturumunu kapatmak için Kaydet ve Çık’a tıklayın.

Representative Results

Toplanan sıvı biyopsi örnekleri, DNA, proteinler, glikanlar ve metabolitlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli moleküler analizlere tabi tutulabilir. Daha önce -70 ° C’de birkaç yıl boyunca uzun süreli depolamanın proteomik profil9’un bütünlüğünü önemli ölçüde etkilemediği gösterilmiştir. REDCap veritabanı, örneklerin basit ve hızlı bir şekilde alınmasını sağlar. Veri tabanı, belirli bir hasta grubundan, örneğin diyabetik retinopatisi olan tüm hastalardan örnekler için aranabilir. Veritabanı daha sonra tüplerin barkodlarını ve depodaki konumları sağlayacaktır. Şimdiye kadar 1.000’den fazla sıvı biyopsi topladık ve arşivledik. Veri tabanı, aşağı akış analizleri 3,10 için numuneleri hızlı bir şekilde bulmamızı sağladı ve aşağıdaki deneyleri gerçekleştirmemize yardımcı oldu. 17 yaşında kadın hasta retina ve optik sinir inflamasyonu ile başvurdu. Bağışıklık sistemi baskılanmıştı ve enfeksiyon endişesi vardı. Sağ gözünden sulu mizah toplandı ve DNA PCR incelemesine gönderildi. Sonuçlar Sitomegalovirüs için pozitif, Herpes simpleks virüsü ve toksoplazmoz için negatifti. Bu bulgular, sulu mizah sıvı biyopsilerinin, uygun tedaviyi seçmek için kritik olan enfeksiyöz olmayan göz içi inflamasyon formlarını enfeksiyöz olmayan formlardan ayırt etmeye yardımcı olabileceğini göstermektedir. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi, proteomun tarafsız ve yarı kantitatif bir analizini sağlar. Vitrektomi uygulanan bir hastanın vitreusundan yapılan sıvı biyopside, teknik, Kompleman C3 (C3), Optikin (OPTC) ve Kollajen Tip II Alfa 1 (COL2A1) dahil olmak üzere 484 benzersiz proteini tanımlayabildi (Şekil 1A). Üç vitreus sıvı biyopsisi glikoproteomik multipleks ELISA kullanılarak analiz edildi (bakınız Malzeme Tablosu)11. Tahlil, 500 insan proteininin glikozilasyon profillerini tespit ederek, metabolizma, bağışıklık tepkisi, hücre yapışması ve aktin organizasyonu gibi çeşitli biyolojik yolları yakaladı (Şekil 1B). Fourier dönüştürülmüş kütle spektrometrisi12 ile birleştirilmiş kılcal elektroforez kullanan bir metabolomik tarama (bakınız Malzeme Tablosu), üç sulu mizah sıvı biyopsi örneğinde 292 farklı metabolit tanımladı. Bir yol analizi (bakınız Malzeme Tablosu)13, amino asit metabolizması, üre döngüsü ve karnitin sentezi dahil olmak üzere çeşitli metabolik yollar tanımlamıştır (Şekil 1C). Şekil 1: Temsili sonuçlar . (A) Sıvı kromatografisi ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) kullanılarak insan vitreus mizahının proteomik analizi, tek bir sıvı biyopsisinde 484 benzersiz protein tanımladı. Protein seviyeleri spektral sayımlara göre gösterilir ve sıralanır. Temsili proteinler mavi renkle vurgulanır. (B) Bir glikoproteomik multipleks ELISA, üç vitreus sıvı biyopsisinde 500 benzersiz proteinin glikozilasyon seviyelerini tespit etti. Bir STRING protein etkileşim analizi, protein etkileşimlerinin kümelerini tanımladı (en az 10 proteinli kümeler gösterilmiştir). Her küme için en önemli ölçüde zenginleştirilmiş yol gösterilir. (C) Kütle spektrometrisi kullanılarak yapılan metabolomik analiz, üç sulu mizah sıvı biyopsisinde 292 farklı metabolit tanımladı. Her nokta bir örneği temsil eder. Çubuğun yüksekliği ortalama metabolit sayısına karşılık gelir, hata çubuğu standart sapmayı temsil eder. Sağ panel, önemli ölçüde zenginleştirilmiş yolları gösterir. Tespit edilen metabolitlerin sayısı (payda) ve her yoldaki (payda) toplam metabolit sayısı gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Hastalardan alınan cerrahi örnekler, canlı insanlarda hastalığın doğrudan moleküler karakterizasyonuna izin verir 2,3,4,14 ve insan hastalığını tam olarak özetlemeyen hücre ve hayvan hastalığı modellerinin sınırlamalarının üstesinden gelmeye yardımcı olabilir 15,16. İnsan dokusunun moleküler analizi, yeni ilaç hedeflerinin seçimini iyileştirebilir ve klinik çalışmaların ve ilaç onayının daha yüksek bir başarı oranına katkıda bulunabilir17. Ek olarak, bu yaklaşım kişiselleştirilmiş tıp için potansiyel sunar, çünkü elde edilen doku her bireyin benzersiz genomik, epigenomik, metabolomik, glikomik ve proteomik parmak izini korur 2,18,19.

Yüksek ve tutarlı numune kalitesi, tüm moleküler analiz uygulamaları için esastır. Önceki çalışmalar, numune alımından sonra derhal dondurmanın ve tekrarlanan donma/çözülme döngülerinden kaçınmanın yüksek numune kalitesi için kritik olduğunu göstermiştir 9,20. -70 ° C’de birkaç yıl boyunca uzun süreli depolama, proteomik profil9’un bütünlüğünü önemli ölçüde etkilemedi. Standartlaştırılmış bir protokol, önyargıyı azaltmak ve bilimsel verilerin karşılaştırılabilirliğini artırmak için önemli bir temeldir, özellikle de birkaç kişi (cerrahlar, teknisyenler ve diğerleri) veya farklı kurumlar örnekleme sürecine dahil olduğunda. Numune kalitesinin yanı sıra, örneklerin ek açıklaması, moleküler bulguların klinik verilerle korelasyonuna izin vermek için standardizasyon gerektiren bir diğer önemli faktördür. Protokolümüz bunu başarmak için üç temel ilkeye dayanmaktadır: 1) bir göz cerrahı tarafından sulu mizah ve vitreus sıvı biyopsileri için standartlaştırılmış bir örnekleme prosedürü, 2) ameliyathanedeki numunelerin laboratuvar personeli tarafından derhal işlenmesi ve anında dondurulması ve 3) araştırmacıların daha sonraki deneyler için örnekleri hızlı bir şekilde bulmalarını sağlayan web tabanlı bir veritabanında her bir numunenin meta veri ek açıklaması.

Vitröz numune20’ye ek olarak, bu iş akışı aynı zamanda moleküler analiz için standartlaştırılmış sulu mizah sıvı biyopsileri koleksiyonunu da oluşturur. Sulu mizah, gözün ön kamarasında yer alan ve sadece ön tarafın oküler hastalıklarını değil, aynı zamanda retina hastalığı da dahil olmak üzere gözün arka segmentinin oküler hastalıklarını yansıtan oldukça erişilebilir, karmaşık bir sıvıdır18,21. Örneğin, dünya çapında en sık uygulanan ameliyatlardan biri olan katarakt ameliyatı sırasında çok sayıda sulu mizah örneği toplanabilmesinin yanı sıra, bu özellikler onu insan gözünden sıvı biyopsiler için ilginç bir kaynak haline getirmektedir. Bu iş akışında oluşturulan her numunenin standartlaştırılmış meta veri ek açıklaması, proteom verilerinin ileriye dönük klinik takip verileriyle korelasyonuna da izin verebilir. Bu, gelecekteki hastalar için prognozu tahmin etmeye yardımcı olabilecek yeni prognostik biyobelirteçleri tanımlamak için heyecan verici bir fırsat sunmaktadır.

Bununla birlikte, insan cerrahi örneklerinin moleküler analizinin de önemli sınırlamaları vardır. Örneğin, karmaşık deneysel manipülasyonlar genellikle sadece hayvan ve hücre modellerinde mümkündür. Bir çözüm, hayvan veya hücre modellerinin moleküler profilini insan hastalığınınkiyle karşılaştırmak olabilir. Bu strateji, insan hastalığı ile ilişkili olan ve klinik çalışmalarda başarılı olması muhtemel en umut verici adayları belirlemek için hayvanlarda veya hücre modellerinde doğrulanabilecek örtüşen protein biyobelirteçlerini ve terapötik hedefleri tanımlayabilir 4,16.

Sonuç olarak, iş akışımız, ameliyathane ile araştırma laboratuvarı arasında, moleküler aşağı akış analizi için yüksek kaliteli cerrahi numunelerin standartlaştırılmış ve yüksek verimli toplanmasına, ek açıklamalarına ve depolanmasına olanak tanıyan pratik bir arayüz oluşturarak gelecekteki çeviri araştırmaları için değerli bir temel oluşturur.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VBM, NIH hibeleri (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 ve P30EY026877), Stanford Optik Disk Drusen Merkezi ve Körlüğü Önleme Araştırması, New York, ABD tarafından desteklenmektedir. JW ve DR, ABD VitreoRetinal Cerrahi Vakfı tarafından desteklenmektedir. DR, Lundbeck Vakfı tarafından desteklenen DARE Bursu tarafından desteklenmektedir.

Materials

0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 68-0703-12 used for aqueous humor samples
1 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-7643 used for vitreous samples
3 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for vitreous biopsies
30-32-gauge needle surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan – –
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA – for vitreous biopsies
Cooling box Standard styrofoam box, whatever available in lab – –
Dry ice Whatever available in lab – –
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable Zebra Symbol  DS9208-SR4NNU21Z Barcode scanner
Human Glycosylation Antibody Array L3  RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA GAH-GCM-L3 –
Mac mini Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA – –
MetaboAnalyst software Pang et al., 2021, PMID: 34019663 – –
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 66-51026 for aqueous humor samples
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-9451 for vitreous samples
REDCap browser-based sample database REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
  2. Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
  3. Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
  4. Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
  5. Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
  6. Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
  7. Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
  8. Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
  9. Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
  10. Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
  11. Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
  12. Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
  13. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
  14. Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
  15. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  16. Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
  17. Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
  18. Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
  19. Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
  20. Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
  21. Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).

Tags

BiobankingLiquid BiopsyAqueous HumorVitreousMolecular ProfilingOcular DiseaseDiagnosticTherapeuticStandardized CollectionData PrivacyBarcodeSample RetrievalProtein AnalysisGlycan AnalysisMetabolite AnalysisAnterior Chamber ParacentesisPhakic EyeVitrectomyVitreoretinal SurgeonUndiluted Sample

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Wolf, J., Chemudupati, T., Kumar, A., Rasmussen, D. K., Wai, K. M., Chang, R. T., Montague, A. A., Tang, P. H., Bassuk, A. G., Dufour, A., Mruthrunjaya, P., Mahajan, V. B. Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses. J. Vis. Exp. (199), e65804, doi:10.3791/65804 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image