JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Биобанкинг биопсии водной и стекловидной жидкости человека для молекулярных анализов

Published: September 11, 2023
doi:
10.3791/65804
, , , , , , , , , , ,
1Molecular Surgery Laboratory,Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Byers Eye Institute,Stanford University, 3Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences,University of Minnesota, 4Retina Consultants of Minnesota, 5Department of Pediatrics,University of Iowa, 6Department of Neurology,University of Iowa, 7The Iowa Neuroscience Institute (INI),University of Iowa, 8Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 9Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 10Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Summary

Этот протокол представляет собой интегрированную платформу биорепозитория для стандартизированного сбора, аннотации и биобанкирования высококачественной водянистой влаги человека и биопсии стекловидного тела для последующего молекулярного анализа, включая протеомику, метаболомику и гликомику.

Abstract

Важнейшей задачей в трансляционных исследованиях является создание жизнеспособного и эффективного интерфейса между уходом за пациентами в операционной (операционной) и исследовательской лабораторией. Здесь мы разработали протокол получения высококачественных жидких биопсий для молекулярных анализов водянистой влаги и стекловидного тела у пациентов, перенесших операцию на глазах. В этом рабочем процессе тележка Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI), оснащенная компьютером, сканером штрих-кода и лабораторными приборами, включая бортовое холодильное хранилище, используется для получения и архивирования биологических образцов человека. Веб-база данных, соответствующая требованиям конфиденциальности, позволяет аннотировать каждый образец в течение всего срока его службы, а декартова система координат позволяет отслеживать каждый образец со штрих-кодом в хранилище, обеспечивая быстрый и точный поиск образцов для последующего анализа. Молекулярная характеристика образцов тканей человека не только служит диагностическим инструментом (например, для различения инфекционного эндофтальмита и других неинфекционных внутриглазных воспалений), но также представляет собой важный компонент трансляционных исследований, позволяющий идентифицировать новые лекарственные мишени, разрабатывать новые диагностические инструменты и персонализированные терапевтические средства.

Introduction

Молекулярное профилирование жидких биопсий из человеческого глаза может захватывать локально обогащенные жидкости, содержащие такие молекулы, как ДНК, РНК, белки, гликаны и метаболиты из узкоспециализированных тканей глаза. Жидкостная биопсия из стекловидного тела в задней камере человеческого глаза оказалась в целом безопасной процедурой1. Они позволяют молекулярно охарактеризовать глазные заболевания у живых людей и предлагают потенциал для определения новых диагностических и терапевтических стратегий 2,3,4. Водянистая влага в передней камере глаза имеет еще более высокую хирургическую доступность и может быть получена в больших количествах, например, во время операции по удалению катаракты, которая является одной из наиболее часто выполняемых операций. Однако до сих пор не существует стандартизированного протокола для сбора, аннотации и биобанкирования биопсии водянистой влаги и стекловидного тела человека для последующего молекулярного анализа, включая протеомику, метаболомику и гликомику.

Здесь мы разработали протокол для сбора и биобанкирования высококачественных жидких биопсий для молекулярных анализов пациентов, перенесших операцию на глазах. Мобильный лабораторный интерфейс операционной (MORLI) позволяет исследователю немедленно мгновенно заморозить собранные образцы в криовиалах со штрих-кодом на сухом льду при температуре -80 °C в операционной (OR). Эта процедура обеспечивает высокое и стабильное качество образца для последующего молекулярного анализа. В дополнение к отличному качеству образцов решающее значение имеет точная аннотация образцов в биобанке. Используя веб-базу данных REDCap (Research Electronic Data Capture) 5, совместимую с HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)5, наш рабочий процесс позволяет хранить подробные метаданные для каждого образца, включая возраст, пол, заболевание, стадию заболевания, тип образца и уникальные особенности операции. Это позволит в будущем осуществлять точный поиск, например, образцов из конкретного заболевания или определенной группы пациентов. Кроме того, точное местоположение каждого образца в морозильной камере архивируется с использованием системы декартовой сетки, которая обеспечивает эффективный поиск образцов для последующих экспериментов. Мы показываем примеры анализа ДНК, белка, гликана и метаболитов.

Наш рабочий процесс представляет собой практическую и эффективную связь между операционной и исследовательской лабораторией и обеспечивает ценную основу для трансляционных исследований.

Protocol

Протокол следует руководящим принципам Институционального наблюдательного совета по исследованиям на людях (IRB) в Стэнфордском университете, США. ВНИМАНИЕ: Этот протокол является руководством для квалифицированных офтальмохирургов. В контексте внутриглазных злокачественных новообразований нельзя исключать экстраокулярный посев опухоли на фоне водянистой влаги или биопсии стекловидного тела. Тем не менее, риск экстраокулярного расширения и вовлечения орбиты чрезвычайно низок при трансвитреальной биопсии опухоли хориоидеи, которая проводится с повышенным уровнем безопасности и с тщательным рассмотрением места входа6. Этот протокол не распространяется и может быть противопоказан в случаях ретинобластомы или опухолей с высоким риском метастазирования. 1. Перед сбором образцов Утверждение институционального наблюдательного совета Получите разрешения от местного IRB до начала эксперимента и выполните соответствующий отбор проб. Исследуемая популяция Критерии включения: Включите всех пациентов (в возрасте от 0 до 99 лет), которые проходят внутриглазную операцию в учреждении, которое обеспечит достаточное количество водянистой влаги или стекловидной жидкости сверх того, что требуется для соответствующих диагностических тестов для оценки состояния пациента, и пациентов, которые хотят участвовать. Критерии исключения: исключить пациентов, которые отказываются участвовать, и беременных женщин. Информированное согласие Получите письменное информированное согласие от каждого пациента в соответствии с протоколом, утвержденным IRB. Заархивируйте подписанное согласие в защищенной базе данных. Обучение задействовано персоналом (хирургами, лаборантами, персоналом операционной, учеными), как описано в этом протоколе. Настройте образец управляющей базы данных. Используйте REDCap в качестве образца веб-базы данных, совместимой с HIPAA, предназначенной для поддержки сбора данных для научных исследований5.ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье описывается использование веб-интерфейса, предоставляемого REDCap, для разработки форм, определения полей, настройки логики ветвления и применения правил проверки данных без необходимости обширных знаний в области программирования. В качестве альтернативы может подойти другое программное обеспечение, такое как стандартные приложения для работы с электронными таблицами. Обеспечьте наличие холодильной камеры, сухого льда, шприца для отбора проб и криовиалов (см. Таблицу материалов). Используйте криовиалы со штрих-кодами, которые постоянно выгравированы на флаконах. Это избавляет от необходимости добавлять идентификаторы пациента на флакон и возможность потери этикетки в условиях замораживания. Сообщите об этом хирургу и лаборанту, который поможет со сбором образца в операционной, по крайней мере, за 24 часа до запланированной операции. 2. Получение хирургических образцов в операционной Интерфейс мобильной операционной лаборатории (MORLI) Установите MORLI в операционной. MORLI включает в себя плоскую поверхность лабораторного стола, компьютер/планшет со сканером штрих-кода с доступом к базе данных REDCap и холодильную камеру с сухим льдом (см. Таблицу материалов).ВНИМАНИЕ: Сухой лед очень холодный. Всегда надевайте перчатки при работе с сухим льдом и не прикасайтесь к нему. Подготовка к отбору проб в операционной Войдите в компьютер/планшет на MORLI и откройте базу данных REDCap. Убедитесь, что информированное согласие было подписано пациентом, и подтвердите это у хирурга. Напомните ему/ей, что требуется неразбавленный образец. Наденьте перчатки. Получите соответствующее количество криовалов со штрих-кодом (0,5 мл для водянистой влаги и 1,9 мл для образцов стекловидного тела) и поместите их там, где они легко доступны. Коллекция жидких биопсий водянистой влагиВНИМАНИЕ: Рассматривайте образцы тканей человека как биологически опасный материал, который требует соответствующих мер предосторожности, таких как лабораторный халат и перчатки, для обеспечения безопасности вовлеченного персонала.ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны выполняться только обученным хирургом-офтальмологом. Жидкая биопсия водянистой влаги может быть получена, например, в начале операции по удалению катаракты, одной из самых частых операций во всем мире.ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильное поле поддерживается в соответствии со стандартными протоколами ухода в операционной. Предоперационные процедуры, связанные с анестезией пациента, следуют стандартным этапам ухода за передней камерой и витреоретинальными операциями.Подготовьте и задрапируйте глаз для операции и поместите стерильное зеркало на веко для оптимальной визуализации стерильного поля. Используйте операционный микроскоп для выполнения парацентеза передней камеры перпендикулярно лимбу с помощью иглы 30-32 G, соединенной со шприцем объемом 1 мл. Используйте ватный наконечник или небольшие щипцы, чтобы стабилизировать глаз во время этой процедуры.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что игла и шприц заблокированы и что в шприце нет давления (перемещая поршень). Убедитесь, что кончик иглы остается над периферической радужной оболочкой в средней передней камере, чтобы избежать повреждения внутриглазных структур. В случае хирургии катаракты игла для получения жидкой биопсии также может войти в переднюю камеру через один из парацентезов, созданных для операции по удалению катаракты. При прямой визуализации с помощью микроскопа вручную аспирируют приблизительно 100 мкл неразбавленной водянистой влаги с помощью шприца объемом 1 мл. Перемещайте поршень шприца недоминантной рукой хирурга или обученным ассистентом, не перемещая иглу.ПРИМЕЧАНИЕ: Получите менее 100 мкл водянистой влаги на случай, если передняя камера разрушится. Аккуратно извлеките иглу из передней камеры.ПРИМЕЧАНИЕ: В факичном глазу держите иглу над радужной оболочкой, чтобы не прикасаться к линзе. Положительное давление на земной шар может увеличить рефлюкс. Освобождение кончика ваты до того, как игла будет извлечена, помогает уменьшить рефлюкс. Отодвиньте поршень и посмотрите, как движется воздух и собранная жидкость. Введите шприц в криовальную камеру. Дополнительный воздух очищает мертвое пространство шприца. Используйте штрих-код на криовиале для сканирования образца в форму REDCap на компьютере в операционной (более подробную информацию см. в шагах 3.1–3.9). Немедленно перенесите криовиал на сухой лед в холодильной камере. Продолжайте операцию, запланированную для пациента (например, операцию по удалению катаракты, как описано ранее7 ). Сбор биопсий стекловидного телаПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны выполняться только обученным витреоретинальным хирургом. Биопсия стекловидного тела может быть получена в начале витрэктомии8. Поскольку цель состоит в том, чтобы собрать неразбавленный образец стекловидного тела, резак для витрэктомии не будет заправлен жидкостью1.ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильное поле поддерживается в соответствии со стандартными протоколами ухода в операционной. Предоперационные процедуры, связанные с анестезией пациента, следуют стандартным этапам ухода за операциями на передней камере и витреоретинальными операциями.Подготовьте и задрапируйте глаз для операции и поместите стерильное зеркало на веко для оптимальной визуализации стерильного поля. Создавайте склеротомии с помощью троакарной канюли 23, 25 или 27 G, следуя стандартным процедурам ухода. Вставьте инфузионную канюлю и визуально подтвердите соответствующее размещение в полости стекловидного тела. В полости стекловидного тела активируйте стекловидный резец без инфузии, чтобы собрать неразбавленный образец стекловидного тела. Вручную аспирируйте от 0,5 до 1,0 мл стекловидного тела с помощью шприца, который соединен с канюлей для экструзии стекловидного тела1. Извлеките стекловидный резец из глаза и включите вливание жидкости. Аспирируйте оставшуюся жидкость внутри трубки в шприц. Отсоедините шприц. Обработайте образец, как описано для образца водянистой влаги в разделе 2.3 (этапы 2.3.5 – 2.3.9). 3. Обработка образцов в операционной и добавление образцов в базу данных Попросите лаборанта взять подготовленный криовиал (0,5 мл для водянистой влаги и 1,9 мл для образцов стекловидного тела) и подойти к хирургу, не прикасаясь к стерильному оборудованию. Попросите лаборанта открыть криовальную систему. Выгрузите шприц непосредственно в криоприемник. Попросите лаборанта немедленно подвести итоги криотерапии. Попросите лаборанта вернуться к MORLI и немедленно перенести образец на сухой лед в холодильной камере (-80 °C). Закройте крышку коробки. Откройте новую форму сбора образцов. Введите следующую информацию в соответствующее поле формы: хирург, место и дата сбора, идентификационный номер пациента и другую основную информацию, такую как возраст, пол, правый или левый глаз, диагноз, предоперационный анамнез (свободным текстом), информацию о процедуре (например, тип операции), а также информацию об образцах, например, количество собранных образцов, тип образцов (водянистая влага, стекловидное тело) и другие детали, такие как объемы. Добавьте штрих-код тюбика с помощью сканера штрих-кода. Нажмите « Отправить/Далее». Повторите шаги с 3.1 по 3.7, если будут собраны дополнительные образцы. Когда все образцы будут защищены, нажмите кнопку Сохранить и отправить в форме сбора образцов REDCap. Затем выйдите из базы данных и компьютера/планшета. 4. Передача криовалов на хранение Транспортируйте образцы на сухом льду в холодильной камере из операционной в лабораторию и поместите их на лабораторный стол рядом с лабораторным компьютером. Войдите в REDCap на компьютере лаборатории, используя свой логин и пароль. Наденьте перчатки. Возьмите один из собранных образцов и отсканируйте штрих-код криовиала в базу данных (подробнее в разделе 5). Немедленно поместите образец обратно на сухой лед. Приобретите вторую емкость, наполненную сухим льдом. Приобретите стеллаж для криовиалов из морозильной камеры с температурой -80 °C. Поместите его во вторую емкость на сухой лед.ПРИМЕЧАНИЕ: Для пробирок с водянистой влагой объемом 0,5 мл потребуется стойка формата 96 и стойка формата 48 для трубок стекловидного тела объемом 1,9 мл. Отсканируйте штрих-код стойки в базу данных (подробнее в разделе 5). Перенесите образец в стойку. Добавьте положение флаконов в стойке в базу данных (подробнее в разделе 5). Нажмите кнопку Сохранить и отправить. Транспортируйте стеллаж с флаконами на сухом льду в холодильник для хранения при температуре -80 °C. Добавьте решетку в определенное положение в холодильнике, используя систему координат. В дальнейшем это позволит легко извлекать образцы для последующего анализа. 5. Образец формы хранения Заполните форму хранения для каждого образца, собранного на этапе ввода формы. Нажмите на пустой кружок или «+» в разделе «Хранилище образцов », чтобы создать и открыть новую форму хранения. Введите дату заполнения этой формы в поле Дата архивной записи. Отсканируйте или введите штрих-код пробирки в разделе «Образец пробирки штрих-кода». Немедленно поместите образец обратно на сухой лед. Выберите, будет ли образец перенесен или образец будет помещен во внутреннее хранилище биорепозитория. Убедитесь, что от пациента было получено письменное информированное согласие, установите флажок в разделе « Проверить соответствие согласия » и введите свое имя в поле «Согласие проверено». Выберите свободное и подходящее место для криовиала в стойке. Перенесите криовиал в этом положении в стойку (например, в положение A1). Держите решетку на сухом льду. На этапе «Местоположение» введите следующую информацию: расположение морозильной камеры в разделе «Морозильная камера», номер полки, на которой будет храниться образец, в разделе «Полка», штрих-код коробки в разделе «Штрих-код коробки», положение пробирки в коробке по строкам (Положение трубки (строка)) и столбцу (Положение трубки (столбец)).ПРИМЕЧАНИЕ: При желании в разделе « Этикетка коробки» также можно ввести этикетку коробки, что может облегчить поиск коробки в морозильной камере. В разделе « Использование » введите следующие сведения: имя проекта, для которого используется образец (имя проекта), объем образца в одной из следующих категорий: полный, частичный, почти пустой или пустой (том образца), а также примечания к хранению, если применимо, в разделе «Примечания к хранилищу».ПРИМЕЧАНИЕ: Дата, время и пользователь, который в последний раз обращался к форме, заполняются автоматически, чтобы обеспечить цепочку поставок, которая может быть проверена и проверена по мере необходимости. Убедитесь, что форма заполнена, нажав кнопку Завершить в разделе Завершить?. Нажмите кнопку Сохранить и выйти из формы. Это вернет вас к обзору пациентов. Для каждой собранной пробирки создайте еще одну форму сбора образцов, нажав «+» в разделе « Хранение образцов». Затем повторите шаги с 5.1 по 5.10. Нажмите кнопку «Сохранить и выйти», чтобы заполнить форму и выйти из базы данных и компьютера/планшета. Перенесите стеллаж для образцов (на сухом льду) в холодильник в заранее указанном месте. 6. Извлечение хирургических образцов для последующего анализа ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы часто архивируются в течение нескольких лет, прежде чем они будут проанализированы. Криовиалы со штрих-кодом и система баз данных REDCap с возможностью поиска позволяют легко находить и определять местонахождение каждого образца для последующего анализа. Определите выборки, представляющие интерес для эксперимента, с помощью функции поиска в базе данных. Это позволит найти, например, все образцы водянистой влаги у пациентов в возрасте от 20 до 40 лет с диабетической ретинопатией. Получите местоположение интересующих криовалов (морозильная камера, полка/стеллаж, стеллаж для образцов, координаты в пределах стеллажа). Запишите их, распечатайте или разместите на мобильном компьютере/планшете, чтобы облегчить поиск образцов в морозильной камере. Пометьте образцы как используемые в базе данных. Нажмите «Сохранить и выйти», чтобы заполнить форму и выйти из REDCap и компьютера/планшета.

Representative Results

Собранные образцы жидкой биопсии могут быть подвергнуты различным молекулярным анализам, включая анализ ДНК, белков, гликанов и метаболитов. Ранее было показано, что длительное хранение в течение нескольких лет при -70 °C не оказывало существенного влияния на целостность протеомного профиля9. База данных REDCap обеспечивает простой и быстрый поиск образцов. В базе данных можно искать образцы от определенной группы пациентов, например, всех пациентов с диабетической ретинопатией. Затем база данных предоставит штрих-коды труб и позиции на складе. На сегодняшний день мы собрали и заархивировали более 1000 жидких биопсий. База данных позволила нам быстро найти образцы для последующего анализа 3,10 и помогла провести следующие эксперименты. 17-летняя девушка обратилась с воспалением сетчатки и зрительного нерва. У нее был ослабленный иммунитет, и было опасение по поводу инфекции. Водянистая влага была взята из ее правого глаза и отправлена на анализ ДНК ПЦР. Результаты были положительными для цитомегаловируса и отрицательными для вируса простого герпеса и токсоплазмоза. Эти результаты показывают, что жидкая биопсия водянистой влаги может помочь отличить инфекционные формы внутриглазного воспаления от неинфекционных, что имеет решающее значение для выбора подходящей терапии. Жидкостная хромато-масс-спектрометрия позволяет проводить объективный и полуколичественный анализ протеома. При жидкостной биопсии из стекловидного тела пациента, перенесшего витрэктомию, метод смог идентифицировать 484 уникальных белка, включая комплемент C3 (C3), оптицин (OPTC) и коллаген II типа альфа-1 (COL2A1) (рис. 1A). Три биопсии стекловидного тела были проанализированы с помощью гликопротеомного мультиплексного ИФА (см. Таблицу материалов)11. Анализ обнаружил профили гликозилирования 500 белков человека, захватывая различные биологические пути, такие как метаболизм, иммунный ответ, клеточная адгезия и организация актина (рис. 1B). Метаболомный скрининг с использованием капиллярного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией12 с преобразованием Фурье (см. Таблицу материалов) идентифицировал 292 различных метаболита в трех образцах жидкой биопсии водянистой влаги. Анализ путей (см. Таблицу материалов)13 выявил различные метаболические пути, включая метаболизм аминокислот, цикл мочевины и синтез карнитина (рис. 1C). Рисунок 1: Репрезентативные результаты . (A) Протеомный анализ стекловидного тела человека с использованием жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) идентифицировал 484 уникальных белка в одной жидкостной биопсии. Уровни белка показаны и ранжированы на основе спектральных подсчетов. Репрезентативные белки выделены синим цветом. (B) Мультиплексный ИФА гликопротеомики обнаружил уровни гликозилирования 500 уникальных белков в трех биопсиях стекловидного тела. Анализ взаимодействия белков STRING выявил кластеры белковых взаимодействий (показаны кластеры, содержащие не менее 10 белков). Наиболее значительно обогащенный путь показан для каждого кластера. (C) Метаболомный анализ с использованием масс-спектрометрии выявил 292 различных метаболита в трех биопсиях жидкой водянистой влаги. Каждая точка представляет собой один образец. Высота полосы соответствует среднему числу метаболитов, полоса погрешности представляет собой стандартное отклонение. На правой панели показаны значительно обогащенные пути. Показано количество обнаруженных метаболитов (числитель), а также общее количество метаболитов в каждом пути (знаменатель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Хирургические образцы, взятые у пациентов, позволяют получить прямую молекулярную характеристику заболевания у живых людей 2,3,4,14 и могут помочь преодолеть ограничения моделей болезней клеток и животных, которые не полностью повторяют заболевание человека 15,16. Молекулярный анализ тканей человека может улучшить выбор новых мишеней для лекарств и может способствовать более высокому уровню успеха клинических испытаний и одобрения лекарств17. Кроме того, этот подход предлагает потенциал для персонализированной медицины, поскольку полученная ткань сохраняет уникальный геномный, эпигеномный, метаболический, гликомный и протеомный отпечаток каждого человека 2,18,19.

Высокое и стабильное качество образцов имеет основополагающее значение для всех применений молекулярного анализа. Предыдущие исследования показали, что немедленное замораживание после извлечения образца и предотвращение повторных циклов замораживания/оттаивания имеют решающее значение для высокого качества образца 9,20. Длительное хранение в течение нескольких лет при -70 °C не оказало существенного влияния на целостность протеомного профиля9. Стандартизированный протокол является важной основой для уменьшения смещения и улучшения сопоставимости научных данных, особенно когда в процессе отбора проб участвуют несколько человек (хирурги, техники и другие) или разные учреждения. Помимо качества образцов, аннотация образцов является еще одним важным фактором, который требует стандартизации, чтобы обеспечить корреляцию молекулярных результатов с клиническими данными. Для достижения этой цели наш протокол опирается на три основных принципа: 1) стандартизированная процедура отбора проб для биопсии водянистой влаги и стекловидного тела офтальмохирургом, 2) немедленная обработка и мгновенное замораживание образцов в операционной персоналом лаборатории и 3) аннотация метаданных каждого образца в веб-базе данных, которая позволяет исследователям быстро находить образцы для последующих экспериментов.

В дополнение к образцам20 стекловидного тела этот рабочий процесс также устанавливает стандартизированную коллекцию жидких биопсий водянистой влаги для молекулярного анализа. Водянистая влага представляет собой легкодоступную сложную жидкость в передней камере глаза, которая отражает не только глазные заболевания переднего, но и заднего отрезка глаза, включая заболевание сетчатки18,21. Наряду с тем фактом, что большое количество образцов водянистой влаги может быть собрано, например, во время операции по удалению катаракты, одной из наиболее часто выполняемых операций во всем мире, эти особенности делают ее интересным источником жидких биопсий из человеческого глаза. Стандартизированная аннотация метаданных каждого образца, установленная в этом рабочем процессе, также может позволить корреляцию данных протеома с проспективными данными клинического наблюдения. Это дает прекрасную возможность определить новые прогностические биомаркеры, которые могут помочь оценить прогноз для будущих пациентов.

Однако молекулярный анализ хирургических образцов человека также имеет важные ограничения. Например, сложные экспериментальные манипуляции часто возможны только на животных и клеточных моделях. Решение может состоять в том, чтобы сравнить молекулярный профиль животных или клеточных моделей с молекулярным профилем болезней человека. Эта стратегия может идентифицировать перекрывающиеся белковые биомаркеры и терапевтические мишени, которые могут быть проверены на животных или клеточных моделях, чтобы определить наиболее перспективных кандидатов, которые коррелируют с заболеванием человека и, вероятно, будут успешными в клинических испытаниях 4,16.

В заключение, наш рабочий процесс устанавливает практический интерфейс между операционной и исследовательской лабораторией, который позволяет стандартизированно и высокопроизводительно собирать, аннотировать и хранить высококачественные хирургические образцы для молекулярного последующего анализа, обеспечивая ценную основу для будущих трансляционных исследований.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VBM поддерживается грантами NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 и P30EY026877), Стэнфордским центром оптических дисков Друзена и Исследованиями по предотвращению слепоты, Нью-Йорк, США. JW и DR поддерживаются Фондом витреоретинальной хирургии, США. DR поддерживается стипендией DARE, которая спонсируется Фондом Лундбека.

Materials

0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 68-0703-12 used for aqueous humor samples
1 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-7643 used for vitreous samples
3 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for vitreous biopsies
30-32-gauge needle surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan – –
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA – for vitreous biopsies
Cooling box Standard styrofoam box, whatever available in lab – –
Dry ice Whatever available in lab – –
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable Zebra Symbol  DS9208-SR4NNU21Z Barcode scanner
Human Glycosylation Antibody Array L3  RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA GAH-GCM-L3 –
Mac mini Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA – –
MetaboAnalyst software Pang et al., 2021, PMID: 34019663 – –
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 66-51026 for aqueous humor samples
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-9451 for vitreous samples
REDCap browser-based sample database REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
  2. Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
  3. Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
  4. Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
  5. Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
  6. Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
  7. Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
  8. Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
  9. Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
  10. Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
  11. Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
  12. Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
  13. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
  14. Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
  15. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  16. Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
  17. Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
  18. Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
  19. Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
  20. Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
  21. Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).

Tags

BiobankingLiquid BiopsyAqueous HumorVitreousMolecular ProfilingOcular DiseaseDiagnosticTherapeuticStandardized CollectionData PrivacyBarcodeSample RetrievalProtein AnalysisGlycan AnalysisMetabolite AnalysisAnterior Chamber ParacentesisPhakic EyeVitrectomyVitreoretinal SurgeonUndiluted Sample

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Wolf, J., Chemudupati, T., Kumar, A., Rasmussen, D. K., Wai, K. M., Chang, R. T., Montague, A. A., Tang, P. H., Bassuk, A. G., Dufour, A., Mruthrunjaya, P., Mahajan, V. B. Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses. J. Vis. Exp. (199), e65804, doi:10.3791/65804 (2023).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image