분자 분석을 위한 인간 수성 및 유리체 액체 생검의 바이오뱅킹

이 프로토콜은 미국 스탠포드 대학의 IRB(Institutional Review Board for Human Subject Research)의 지침을 따릅니다. 주의 : 이 프로토콜은 자격을 갖춘 안과 의사를 위한 안내서입니다. 안내 악성 종양의 맥락에서, 방수액 또는 유리체 액체 생검의 설정에서 안구 외 종양 파종을 배제 할 수 없습니다. 그러나, 유리체강막 맥락막 종양 생검에서는 안구 외 확장 및 안와 침범의 위험이 극히 낮으며, 이는 안전성이 강화된 방식으로 신중한 진입 부위 고려와 함께 수행된다6. 이 프로토콜은 망막모세포종 또는 전이성 위험이 높은 종양의 경우 적용되지 않으며 금기일 수 있습니다. 1. 샘플 채취 전 기관 검토 위원회 승인 실험을 시작하기 전에 현지 IRB로부터 승인을 받고 그에 따라 샘플 수집을 수행합니다. 연구 모집단 포함 기준: 환자의 상태를 평가하기 위한 적절한 진단 검사에 필요한 양을 초과하는 적절한 양의 방수액 또는 유리체를 제공하는 기관에서 안내 수술을 받는 모든 환자(0 – 99세)와 참여를 원하는 환자를 포함합니다. 제외 기준: 참여를 거부하는 환자와 임산부를 제외합니다. 정보에 입각한 동의 IRB 승인 프로토콜에 따라 각 환자로부터 서면 동의서를 얻습니다. 서명된 동의서를 보안 데이터베이스에 보관합니다. 이 프로토콜에 설명된 대로 관련 직원(외과의, 실험실 기술자, 수술실(OR) 직원, 과학자)을 교육합니다. 샘플 관리 데이터베이스를 설정합니다. REDCap을 연구 연구를 위한 데이터 캡처를 지원하도록 설계된 HIPAA 준수 웹 기반 샘플 데이터베이스로 사용5.참고: 이 문서에서는 양식을 디자인하고, 필드를 정의하고, 분기 논리를 설정하고, 광범위한 프로그래밍 지식 없이도 데이터 유효성 검사 규칙을 적용하려면 REDCap에서 제공하는 웹 기반 인터페이스를 사용하는 방법을 설명합니다. 대안적으로, 표준 스프레드시트 애플리케이션과 같은 다른 소프트웨어가 또한 적합할 수 있다. 냉각 상자, 드라이아이스, 샘플 수집을 위한 주사기 및 극저온 액체의 가용성을 보장합니다( 재료 표 참조). 바이알에 영구적으로 에칭되는 바코드가 있는 극저온 혼합물을 사용하십시오. 이렇게 하면 바이알에 환자 식별자를 추가할 필요가 없으며 동결 조건에서 라벨이 손실될 가능성이 없습니다. 예정된 수술 최소 24시간 전에 수술실에서 샘플 수집을 도와줄 사례와 실험실 기술자에게 알리십시오. 2. 수술실에서 수술 표본 획득 이동식 수술실 실험실 인터페이스(MORLI) 수술실에 MORLI를 설치하십시오. MORLI에는 평평한 실험실 벤치 표면, REDCap 데이터베이스에 액세스할 수 있는 바코드 스캐너가 있는 컴퓨터/태블릿, 드라이아이스가 있는 냉각 상자가 포함되어 있습니다( 재료 표 참조).주의 : 드라이 아이스는 매우 차갑습니다. 드라이아이스를 다룰 때는 항상 장갑을 착용하고 만지지 마십시오. 수술실에서 시료 채취 준비 MORLI에서 컴퓨터/태블릿에 로그인하고 REDCap 데이터베이스를 엽니다. 환자가 정보에 입각한 동의서에 서명했는지 확인하고 외과의와 확인하십시오. 희석되지 않은 샘플이 필요하다는 것을 상기시킵니다. 장갑을 착용하십시오. 적절한 수의 바코드가 부착된 극저온 액체(방수의 경우 0.5mL, 유리질 샘플의 경우 1.9mL)를 구하여 쉽게 접근할 수 있는 곳에 놓습니다. 수액 액체 생검 수집주의 : 인체 조직 샘플을 생물학적 유해 물질로 간주하여 관련 직원의 안전을 보장하기 위해 실험실 코트 및 장갑과 같은 적절한 예방 조치가 필요합니다.알림: 다음 단계는 숙련된 안과 의사만 수행해야 합니다. 수액 액체 생검은 예를 들어 전 세계적으로 가장 빈번한 수술 중 하나 인 백내장 수술 초기에 얻을 수 있습니다.알림: 멸균 필드는 수술실의 표준 치료 프로토콜에 따라 유지됩니다. 환자 마취와 관련된 수술 전 절차는 전방 및 유리체 망막 수술에 대한 표준 치료 단계를 따릅니다.수술을 위해 눈을 준비하고 드레이프하고 멸균 부위의 최적 시각화를 위해 멸균 뚜껑 검경을 놓습니다. 작동 현미경을 사용하여 1mL 주사기에 연결된 30-32G 바늘을 사용하여 윤부에 수직인 전방 천자를 수행합니다. 이 과정에서 면봉이나 작은 집게를 사용하여 눈을 안정시키십시오.알림: 바늘과 주사기가 잠겨 있고 주사기에 압력이 가해지지 않았는지 확인하십시오(플런저를 움직여 말입니다). 안구 구조의 손상을 방지하기 위해 바늘 끝이 중간 전방의 주변 홍채 위에 남아 있는지 확인하십시오. 백내장 수술의 경우, 액체 생검을 얻는 바늘은 백내장 수술을 위해 생성 된 천자 중 하나를 통해 전방으로 들어갈 수도 있습니다. 현미경을 통한 직접 시각화 하에서 1mL 주사기를 사용하여 약 100μL의 희석되지 않은 방수를 수동으로 흡인합니다. 바늘을 움직이지 않고 외과의의 비지배적인 손으로 또는 훈련된 조수로 주사기 플런저를 움직입니다.알림: 전방이 무너져야 하는 경우에 대비하여 100μL 미만의 방수를 얻으십시오. 전방에서 바늘을 조심스럽게 제거합니다.알림: phakic 눈에서는 렌즈를 만지지 않도록 바늘을 홍채 위에 두십시오. 지구에 대한 양압은 역류를 증가시킬 수 있습니다. 바늘을 빼기 전에 면봉을 풀어주면 역류를 줄이는 데 도움이 됩니다. 플런저를 뒤로 당기고 공기와 수집된 유체가 어떻게 움직이는지 확인합니다. 주사기를 극저온 장치에 주입합니다. 여분의 공기는 주사기의 데드 스페이스를 제거합니다. 극저온 난자의 바코드를 사용하여 수술실에 있는 컴퓨터의 REDCap 양식으로 샘플을 스캔합니다(자세한 내용은 3.1-3.9단계 참조). 즉시 냉동 상자에 있는 드라이아이스로 극저온을 옮깁니다. 환자에게 예정된 수술을 계속합니다(예: 앞서 설명한 백내장 수술7 ). 유리질 액체 생검 수집알림: 다음 단계는 훈련된 유리체 망막 외과의만 수행해야 합니다. 유리체 액체 생검은 유리체 절제술시작 시 얻을 수 있다 8. 목표는 희석되지 않은 유리체 샘플을 수집하는 것이기 때문에 유리체 절제술 절단기는 유체1로 프라이밍되지 않습니다.알림: 멸균 필드는 수술실의 표준 치료 프로토콜에 따라 유지됩니다. 환자 마취와 관련된 수술 전 절차는 전방 및 유리체 망막 수술에 대한 표준 치료 단계를 따릅니다.수술을 위해 눈을 준비하고 드레이프하고 멸균 부위의 최적 시각화를 위해 멸균 뚜껑 검경을 놓습니다. 표준 치료 절차에 따라 23G, 25G 또는 27G 투관침 캐뉼라로 경화술을 만듭니다. 주입 캐뉼라를 삽입하고 유리체강에 적절한 배치를 육안으로 확인하십시오. 유리체 구멍에서 주입 없이 유리체 절단기를 활성화하여 희석되지 않은 유리체 샘플을 수집합니다. 유리체 압출 캐뉼라 1에 연결된 주사기를 사용하여 0.5 내지1.0 mL의 유리체를 수동으로 흡인한다. 유리체 절단기를 눈에서 제거하고 유체 주입을 켭니다. 튜브 내에 남아 있는 유체를 주사기로 흡인합니다. 주사기를 분리합니다. 섹션 2.3(단계 2.3.5 내지 단계 2.3.9)에서 수성 유머 표본에 대해 설명된 대로 샘플을 처리합니다. 3. 수술실에서 시료 처리 및 데이터베이스에 시료 추가 실험실 기술자에게 준비된 극저온 액체(방수의 경우 0.5mL, 유리체 샘플의 경우 1.9mL)를 채취하여 멸균 수술실 장비를 건드리지 않고 외과의에게 걸어가도록 요청하십시오. 실험실 기술자에게 극저온 액체를 열도록 요청하십시오. 주사기를 극저온 액체에 직접 내립니다. 실험실 기술자에게 극저온 상태를 즉시 요약하도록 요청하십시오. 실험실 기술자에게 MORLI로 돌아가 즉시 샘플을 냉각 상자(-80°C)의 드라이아이스로 옮기도록 요청하십시오. 상자의 뚜껑을 닫습니다. 새 샘플 수집 양식을 엽니다. 양식의 각 필드에 다음 정보를 입력합니다: 사례 외과의, 수집 위치 및 날짜, 환자 식별자 번호 및 연령, 성별, 오른쪽 또는 왼쪽 눈, 진단, 수술 전 이력(자유 텍스트), 절차에 대한 정보(예: 수술 유형) 및 수집된 샘플 수와 같은 샘플에 대한 정보, 샘플의 유형(수성액, 유리체) 및 부피와 같은 기타 세부 사항. 바코드 스캐너를 사용하여 튜브 바코드를 추가합니다. Submit/ Next(제출/다음)를 클릭합니다. 추가 샘플이 수집되는 경우 3.1-3.7단계를 반복합니다. 모든 샘플이 보호되면 REDCap 샘플 수집 양식에서 저장 및 제출 을 클릭합니다. 그런 다음 데이터베이스와 컴퓨터/태블릿에서 로그아웃합니다. 4. cryovials를 저장소로 옮기기 냉각 상자에 담긴 드라이아이스에 담긴 샘플을 수술실에서 실험실로 운반하고 실험실 컴퓨터 옆의 실험실 벤치에 놓습니다. 로그인 ID와 암호를 사용하여 실험실 컴퓨터에서 REDCap에 로그인합니다. 장갑을 착용하십시오. 수집된 샘플 중 하나를 채취하여 극저온 바코드를 데이터베이스로 스캔합니다(자세한 내용은 섹션 5 참조). 즉시 샘플을 드라이 아이스에 다시 놓습니다. 드라이 아이스로 채워진 두 번째 용기를 얻습니다. -80°C 냉동고에서 극저온 판독용 랙을 얻습니다. 드라이 아이스의 두 번째 용기에 넣으십시오.알림: 96mL 방수관에는 0.5형식 랙이 필요하고 48mL 유리관에는 1.9형식 랙이 필요합니다. 랙의 바코드를 데이터베이스로 스캔합니다(자세한 내용은 섹션 5 참조). 샘플을 랙으로 옮깁니다. 랙에 있는 바이알의 위치를 데이터베이스에 추가합니다(자세한 내용은 섹션 5 참조). Save and submit(저장 및 제출)을 클릭합니다. 드라이아이스에 담긴 바이알이 있는 랙을 냉장고로 운반하여 -80°C에서 보관합니다. 좌표계를 사용하여 냉장고의 특정 위치에 랙을 추가합니다. 이렇게 하면 나중에 다운스트림 분석을 위해 샘플을 쉽게 검색할 수 있습니다. 5. 샘플 저장 형태 입력 양식 단계에서 수집된 각 샘플에 대한 저장 양식을 작성하십시오. 빈 원을 클릭하거나 Sample Storage 아래의 “+”를 클릭하여 새 스토리지 양식을 만들고 엽니다. 기록 보관 날짜 아래에 이 양식이 작성된 날짜를 입력합니다. Specimen Tube Barcode(표본 튜브 바코드) 아래에 튜브 바코드를 스캔하거나 입력합니다. 즉시 샘플을 드라이 아이스에 다시 놓습니다. 검체가 외부로 이송되는지 또는 검체가 내부 생물 저장소 저장소로 이동할지 여부를 선택합니다. 환자로부터 서면 동의서를 받았는지 확인하고 Verify Consent Compliance(동의 규정 준수 확인) 아래의 확인란을 선택하고 Consent verified by(동의 확인자) 아래에 이름을 입력합니다. 랙에서 극저온 이온에 적합한 자유 위치를 선택하십시오. 이 위치의 극저온 액체를 랙(예: 위치 A1)으로 옮깁니다. 랙을 드라이 아이스에 보관하십시오. 위치 단계에서 냉동실 아래의 냉동고 위치, 선반 아래에 샘플이 저장될 선반 번호, 박스 바코드 아래의 박스 바코드, 행 별 상자 내 튜브 위치(튜브 위치(행)) 및 열(튜브 위치(열))과 같은 정보를 입력합니다. 알림: 선택적으로 상자 라벨 아래에 상자 라벨을 입력할 수도 있으며, 이를 통해 냉동실에서 상자를 쉽게 찾을 수 있습니다. 사용량 섹션에서 샘플이 사용되는 프로젝트 이름(프로젝트 이름), 전체, 부분, 거의 비어 있거나 비어 있는 범주(표본 볼륨) 중 하나의 표본 볼륨, 스토리지 메모 아래에 해당하는 경우 보관 메모 등의 정보를 입력합니다.참고: 양식에 마지막으로 액세스한 날짜, 시간 및 사용자가 자동으로 채워져 필요에 따라 검토 및 감사할 수 있는 관리 연속성을 보장합니다. Complete(완료)에서 Complete(완료)를 클릭하여 양식이 완료되었는지 확인합니다. Save & Exit Form(저장 및 종료 양식)을 클릭합니다. 그러면 환자 개요로 돌아갑니다. 수집된 모든 튜브에 대해 Sample Storage에서 “+”를 클릭하여 다른 샘플 수집 양식을 생성합니다. 그런 다음 5.1-5.10단계를 반복합니다. Save and Exit(저장 및 종료)를 클릭하여 양식을 작성하고 데이터베이스와 컴퓨터/태블릿에서 로그아웃합니다. 샘플 랙(드라이아이스)을 미리 지정된 위치의 냉장고로 옮깁니다. 6. 다운스트림 분석을 위한 수술 표본 검색 참고: 표본은 분석되기 전에 몇 년 동안 보관되는 경우가 많습니다. 바코드가 부착된 극저온 액체와 검색 가능한 REDCap 데이터베이스 시스템을 통해 다운스트림 분석을 위해 각 샘플을 쉽게 찾고 찾을 수 있습니다. 데이터베이스의 검색 기능을 사용하여 실험에 대한 관심 샘플을 식별합니다. 이를 통해 예를 들어 당뇨병성 망막병증이 있는 20세에서 40세 사이의 환자로부터 모든 방수액 샘플을 찾을 수 있습니다. 관심 있는 극저온의 위치(냉동고, 선반/랙, 샘플 랙, 랙 내 좌표)를 얻습니다. 그것들을 기록하거나, 인쇄하거나, 모바일 컴퓨터/태블릿에서 사용할 수 있도록 하여 냉동실에서 샘플을 쉽게 찾을 수 있도록 합니다. 데이터베이스에서 사용된 샘플을 표시합니다. 저장 및 종료를 클릭하여 양식을 작성하고 REDCap 및 컴퓨터/태블릿에서 로그아웃합니다.