Generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus
Summary
Hemos desarrollado varios protocolos para inducir daño retiniano o degeneración retiniana en renacuajos de Xenopus laevis . Estos modelos ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos de regeneración de la retina.
Abstract
Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son las principales causas de ceguera. Entre las numerosas estrategias terapéuticas que se están explorando, la estimulación de la autorreparación ha surgido recientemente como particularmente atractiva. Una fuente celular de interés para la reparación de la retina es la célula glial de Müller, que alberga potencial de células madre y una extraordinaria capacidad regenerativa en los anamniotas. Sin embargo, este potencial es muy limitado en los mamíferos. El estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración de la retina en modelos animales con capacidades regenerativas debería proporcionar información sobre cómo desbloquear la capacidad latente de las células de Müller de mamíferos para regenerar la retina. Este es un paso clave para el desarrollo de estrategias terapéuticas en medicina regenerativa. Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión retiniana en Xenopus: una lesión retiniana mecánica, una línea transgénica que permite la ablación condicional de fotorreceptores mediada por nitroreductasa, un modelo de retinosis pigmentaria basado en la eliminación de rodopsina mediada por CRISPR/Cas9 y un modelo citotóxico impulsado por inyecciones intraoculares de CoCl2 . Destacando sus ventajas y desventajas, describimos aquí esta serie de protocolos que generan diversas condiciones degenerativas y permiten el estudio de la regeneración retiniana en Xenopus.
Introduction
Millones de personas en todo el mundo padecen diversas enfermedades degenerativas de la retina que conducen a la ceguera, como la retinosis pigmentaria, la retinopatía diabética o la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Hasta la fecha, estas afecciones siguen siendo en gran medida intratables. Los enfoques terapéuticos actuales que se están evaluando incluyen la terapia génica, los trasplantes de células o tejidos, los tratamientos neuroprotectores, la optogenética y los dispositivos protésicos. Otra estrategia emergente se basa en la autorregeneración a través de la activación de células endógenas con potencial de células madre. Las células gliales de Müller, el principal tipo de célula glial de la retina, se encuentran entre las fuentes celulares de interés en este contexto. Al lesionarse, pueden desdiferenciarse, proliferar y generar neuronas 1,2,3. Aunque este proceso es muy efectivo en el pez cebra o Xenopus, es en gran medida ineficiente en los mamíferos.
Sin embargo, se ha demostrado que los tratamientos apropiados con proteínas mitogénicas o la sobreexpresión de diversos factores pueden inducir la reentrada en el ciclo celular de la glía de Müller en mamíferos y, en algunos casos, desencadenar su posterior compromiso neurogénico 1,2,3,4,5. Sin embargo, esto sigue siendo en gran medida insuficiente para los tratamientos. Por lo tanto, es necesario aumentar nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración para identificar moléculas capaces de convertir de manera eficiente las propiedades de las células madre de Müller en nuevas estrategias terapéuticas celulares.
Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión en Xenopus que desencadenan la degeneración de las células de la retina. Aquí, presentamos (1) una lesión mecánica de la retina que no es específica del tipo de célula, (2) un modelo de ablación celular condicional y reversible utilizando el sistema NTR-MTZ que se dirige a los bastones, (3) un knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, un modelo de retinosis pigmentaria que desencadena la degeneración progresiva de los bastones, y (4) un CoCl2-modelo citotóxico inducido que, según la dosis, puede dirigirse específicamente a los conos o provocar una degeneración más amplia de las células de la retina. Destacamos las particularidades, ventajas y desventajas de cada paradigma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ventajas y desventajas de varios paradigmas de lesión retiniana en renacuajos de Xenopus
Lesión mecánica de la retina
Se han desarrollado varias lesiones quirúrgicas de la retina neural en renacuajos de Xenopus. La retina neural puede ser extirpada por completo15,16 o sólo parcialmenteextirpada 16,17. La lesión mecán…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación contó con el apoyo de becas a M.P. de la Association Retina France, la Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) y UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) en colaboración con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
Riferimenti
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