Создание моделей повреждений сетчатки у головастиков Xenopus
Summary
Мы разработали несколько протоколов для индуцирования повреждения или дегенерации сетчатки у головастиков Xenopus laevis . Эти модели дают возможность изучать механизмы регенерации сетчатки.
Abstract
Нейродегенеративные заболевания сетчатки являются основными причинами слепоты. Среди многочисленных терапевтических стратегий, которые изучаются, стимулирующее самовосстановление в последнее время стало особенно привлекательным. Клеточным источником, представляющим интерес для восстановления сетчатки, является глиальная клетка Мюллера, которая обладает потенциалом стволовых клеток и необычайной регенеративной способностью у анамнетов. Однако у млекопитающих этот потенциал очень ограничен. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе регенерации сетчатки на животных моделях с регенеративными способностями, должно дать представление о том, как разблокировать скрытую способность клеток Мюллера млекопитающих регенерировать сетчатку. Это ключевой шаг для разработки терапевтических стратегий в регенеративной медицине. С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждения сетчатки в Xenopus: механическое повреждение сетчатки, трансгенная линия, позволяющая проводить условную абляцию фоторецепторов, опосредованную нитроредуктазой, модель пигментного ретинита, основанная на нокауте родопсина , опосредованного CRISPR/Cas9, и цитотоксическая модель, управляемая внутриглазными инъекциями CoCl2 . Выделяя их преимущества и недостатки, мы описываем здесь эту серию протоколов, которые порождают различные дегенеративные состояния и позволяют изучать регенерацию сетчатки у Xenopus.
Introduction
Миллионы людей во всем мире страдают от различных дегенеративных заболеваний сетчатки, приводящих к слепоте, таких как пигментный ретинит, диабетическая ретинопатия или возрастная макулярная дегенерация (ВМД). На сегодняшний день эти состояния остаются в значительной степени неизлечимыми. В настоящее время оцениваются терапевтические подходы, включающие генную терапию, трансплантацию клеток или тканей, нейропротекторное лечение, оптогенетику и протезы. Другая новая стратегия основана на саморегенерации путем активации эндогенных клеток с потенциалом стволовых клеток. Глиальные клетки Мюллера, основной тип глиальных клеток сетчатки, являются одним из клеточных источников, представляющих интерес в этом контексте. При травме они могут дедифференцироваться, размножаться и генерировать нейроны 1,2,3. Хотя этот процесс очень эффективен у рыбок данио или ксенопусов, он в значительной степени неэффективен у млекопитающих.
Тем не менее, было показано, что соответствующее лечение митогенными белками или гиперэкспрессией различных факторов может индуцировать повторный вход в клеточный цикл глии Мюллера у млекопитающих и, в некоторых случаях, вызвать их последующее участие в нейрогенезе 1,2,3,4,5. Тем не менее, этого остается в значительной степени недостаточно для лечения. Следовательно, расширение наших знаний о молекулярных механизмах, лежащих в основе регенерации, необходимо для выявления молекул, способных эффективно превращать свойства стволовых клеток Мюллера в новые клеточные терапевтические стратегии.
С этой целью мы разработали несколько парадигм повреждений у Xenopus , которые запускают дегенерацию клеток сетчатки. Здесь мы представляем (1) механическое повреждение сетчатки, которое не является специфичным для типа клетки, (2) условную и обратимую модель абляции клеток с использованием системы NTR-MTZ, которая нацелена на палочковые клетки, (3) CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут родопсина , модель пигментного ретинита, которая вызывает прогрессирующую дегенерацию палочек клеток, и (4) CoCl2-индуцированная цитотоксическая модель, которая в зависимости от дозы может специфически воздействовать на колбочки или приводить к более широкой дегенерации клеток сетчатки. Выделены особенности, преимущества и недостатки каждой парадигмы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущества и недостатки различных парадигм повреждения сетчатки у головастиков Xenopus
Механическая травма сетчатки
У головастиков Xenopus развились различные хирургические повреждения нервной сетчатки. Нервная сетчатка может быть удалена л?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование выполнено при поддержке грантов Ассоциации сетчатки Франции, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) и UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) в партнерстве с ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, Sciences Cognitives, Neneurologye, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
Riferimenti
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Biologia dello sviluppo. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
