Generierung von Netzhautverletzungsmodellen bei Xenopus-Kaulquappen
Summary
Wir haben mehrere Protokolle entwickelt, um Netzhautschäden oder Netzhautdegeneration bei Xenopus laevis-Kaulquappen zu induzieren. Diese Modelle bieten die Möglichkeit, die Regenerationsmechanismen der Netzhaut zu untersuchen.
Abstract
Neurodegenerative Netzhauterkrankungen sind die Hauptursachen für Erblindung. Unter den zahlreichen therapeutischen Strategien, die erforscht werden, hat sich in jüngster Zeit die Stimulierung der Selbstreparatur als besonders attraktiv erwiesen. Eine zelluläre Quelle von Interesse für die Netzhautreparatur ist die Müller-Gliazelle, die Stammzellpotenzial und eine außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit in Anamnioten birgt. Dieses Potenzial ist jedoch bei Säugetieren sehr begrenzt. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die der Netzhautregeneration in Tiermodellen mit regenerativen Fähigkeiten zugrunde liegen, soll Aufschluss darüber geben, wie die latente Fähigkeit von Säugetier-Müller-Zellen zur Regeneration der Netzhaut freigesetzt werden kann. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Entwicklung therapeutischer Strategien in der regenerativen Medizin. Zu diesem Zweck haben wir mehrere Paradigmen für Netzhautverletzungen in Xenopus entwickelt: eine mechanische Netzhautverletzung, eine transgene Linie, die eine bedingte Ablation von Nitroreduktase-vermittelten Photorezeptoren ermöglicht, ein Retinitis pigmentosa-Modell, das auf einem CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout basiert, und ein zytotoxisches Modell, das durch intraokulare CoCl2-Injektionen gesteuert wird. Unter Hervorhebung ihrer Vor- und Nachteile beschreiben wir hier diese Reihe von Protokollen, die verschiedene degenerative Zustände hervorrufen und die Untersuchung der Netzhautregeneration bei Xenopus ermöglichen.
Introduction
Millionen von Menschen weltweit leiden an verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen, die zur Erblindung führen, wie z. B. Retinitis pigmentosa, diabetische Retinopathie oder altersbedingte Makuladegeneration (AMD). Bis heute sind diese Erkrankungen weitgehend unbehandelbar. Zu den derzeit untersuchten therapeutischen Ansätzen gehören Gentherapie, Zell- oder Gewebetransplantationen, neuroprotektive Behandlungen, Optogenetik und Prothesen. Eine weitere neue Strategie basiert auf der Selbstregeneration durch die Aktivierung körpereigener Zellen mit Stammzellpotenzial. Müller-Gliazellen, der wichtigste Gliazelltyp der Netzhaut, gehören zu den zellulären Quellen von Interesse in diesem Zusammenhang. Bei Verletzungen können sie dedifferenzieren, sich vermehren und Neuronen erzeugen 1,2,3. Obwohl dieser Prozess bei Zebrafischen oder Xenopus sehr effektiv ist, ist er bei Säugetieren weitgehend ineffizient.
Nichtsdestotrotz konnte gezeigt werden, dass geeignete Behandlungen mit mitogenen Proteinen oder die Überexpression verschiedener Faktoren den Wiedereintritt in den Zyklus der Müllergliazellen von Säugetieren induzieren und in einigen Fällen deren anschließende Neurogeneseverpflichtung auslösen können 1,2,3,4,5. Für die Behandlung ist dies jedoch nach wie vor weitgehend unzureichend. Daher ist es notwendig, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die der Regeneration zugrunde liegen, zu erweitern, um Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, die Eigenschaften von Müller-Stammzellen effizient in neue zelluläre therapeutische Strategien umzuwandeln.
Zu diesem Zweck haben wir mehrere Verletzungsparadigmen in Xenopus entwickelt, die die Degeneration von Netzhautzellen auslösen. Hier präsentieren wir (1) eine mechanische Netzhautverletzung, die nicht zelltypspezifisch ist, (2) ein konditionelles und reversibles Zellablationsmodell mit dem NTR-MTZ-System, das auf Stäbchenzellen abzielt, (3) einen CRISPR/Cas9-vermittelten Rhodopsin-Knockout , ein Modell der Retinitis pigmentosa, das eine progressive Stäbchenzelldegeneration auslöst, und (4) ein CoCl2-induziertes zytotoxisches Modell, das je nach Dosis spezifisch auf Zapfen abzielen oder zu einer breiteren Degeneration von Netzhautzellen führen kann. Wir beleuchten die Besonderheiten, Vor- und Nachteile der einzelnen Paradigmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vor- und Nachteile verschiedener Netzhautverletzungsparadigmen bei Xenopus-Kaulquappen
Mechanische Netzhautverletzung
Bei Xenopus-Kaulquappen haben sich verschiedene chirurgische Verletzungen der neuralen Netzhaut entwickelt. Die neurale Netzhaut kann entweder vollständig entfernt werden 15,16 oder nur teilweise entfernt werden16,17.<sup class="…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Stipendien an M.P. von der Association Retina France, der Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) und UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in Zusammenarbeit mit ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé) unterstützt.
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
Riferimenti
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