Modellen voor netvliesletsel genereren bij xenopus-kikkervisjes
Summary
We hebben verschillende protocollen ontwikkeld om schade aan het netvlies of degeneratie van het netvlies te induceren bij kikkervisjes van Xenopus laevis . Deze modellen bieden de mogelijkheid om retinale regeneratiemechanismen te bestuderen.
Abstract
Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaken van blindheid. Van de vele therapeutische strategieën die worden onderzocht, is het stimuleren van zelfherstel onlangs bijzonder aantrekkelijk gebleken. Een cellulaire bron van belang voor herstel van het netvlies is de Müller-gliacel, die stamcelpotentieel en een buitengewoon regeneratief vermogen in anamniotes herbergt. Dit potentieel is echter zeer beperkt bij zoogdieren. Het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de regeneratie van het netvlies in diermodellen met regeneratieve vermogens zou inzicht moeten geven in hoe het latente vermogen van Müller-cellen van zoogdieren om het netvlies te regenereren kan worden ontsloten. Dit is een belangrijke stap voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën in de regeneratieve geneeskunde. Om dit doel te bereiken, ontwikkelden we verschillende paradigma’s voor netvliesbeschadiging in Xenopus: een mechanisch netvliesletsel, een transgene lijn die nitroreductase-gemedieerde voorwaardelijke ablatie van fotoreceptoren mogelijk maakt, een retinitis pigmentosa-model op basis van CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , en een cytotoxisch model aangedreven door intraoculaire CoCl2-injecties . Door hun voor- en nadelen te benadrukken, beschrijven we hier deze reeks protocollen die verschillende degeneratieve aandoeningen genereren en de studie van retinale regeneratie bij Xenopus mogelijk maken.
Introduction
Miljoenen mensen over de hele wereld lijden aan verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies die leiden tot blindheid, zoals retinitis pigmentosa, diabetische retinopathie of leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD). Tot op heden blijven deze aandoeningen grotendeels onbehandelbaar. De huidige therapeutische benaderingen die worden geëvalueerd, omvatten gentherapie, cel- of weefseltransplantaties, neuroprotectieve behandelingen, optogenetica en protheses. Een andere opkomende strategie is gebaseerd op zelfregeneratie door de activering van endogene cellen met stamcelpotentieel. Müller-gliacellen, het belangrijkste gliaceltype van het netvlies, behoren tot de cellulaire bronnen die in deze context van belang zijn. Bij letsel kunnen ze dedifferentiëren, prolifereren en neuronen genereren 1,2,3. Hoewel dit proces zeer effectief is bij zebravissen of Xenopus, is het grotendeels inefficiënt bij zoogdieren.
Desalniettemin is aangetoond dat geschikte behandelingen met mitogene eiwitten of overexpressie van verschillende factoren de terugkeer van de Müller-gliacelcyclus van zoogdieren kunnen induceren en, in sommige gevallen, hun daaropvolgende neurogenese-verbintenis kunnen veroorzaken 1,2,3,4,5. Dit blijft echter grotendeels onvoldoende voor behandelingen. Daarom is het vergroten van onze kennis van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan regeneratie noodzakelijk om moleculen te identificeren die in staat zijn om de eigenschappen van Müller-stamcellen efficiënt om te zetten in nieuwe cellulaire therapeutische strategieën.
Met dit doel voor ogen ontwikkelden we verschillende letselparadigma’s in Xenopus die retinale celdegeneratie veroorzaken. Hier presenteren we (1) een mechanisch netvliesletsel dat niet specifiek is voor het celtype, (2) een voorwaardelijk en omkeerbaar celablatiemodel met behulp van het NTR-MTZ-systeem dat zich richt op staafcellen, (3) een CRISPR/Cas9-gemedieerde rodopsine-knock-out , een model van retinitis pigmentosa dat progressieve staafceldegeneratie veroorzaakt, en (4) een CoCl2-geïnduceerd cytotoxisch model dat, afhankelijk van de dosis, zich specifiek op kegeltjes kan richten of kan leiden tot bredere degeneratie van retinale cellen. We belichten de bijzonderheden, voor- en nadelen van elk paradigma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor- en nadelen van verschillende paradigma’s voor netvliesbeschadiging bij Xenopus-kikkervisjes
Mechanisch netvliesletsel
Verschillende chirurgische verwondingen van het neurale netvlies zijn ontwikkeld bij Xenopus-kikkervisjes. Het neurale netvlies kan ofwel volledig worden verwijderd15,16 of slechts gedeeltelijk worden weggesneden 16,17.<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies aan M.P. van de Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) en UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) in samenwerking met ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).
Materials
| 1,2-Propanediol (propylène glycol) | Sigma-Aldrich | 398039 | |
| Absolute ethanol ≥99.8% | VWR chemicals | 20821-365 | |
| Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) | Cell signaling | 9661S | Dilution 1/300 |
| Anti-GFP antibody (chicken) | Aveslabs | GFP-1020 | Dilution 1/500 |
| Anti-M-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5405 | Dilution 1/500 |
| Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11005 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Otx2 antibody (rabbit) | Abcam | Ab183951 | Dilution 1/100 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11008 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) | Invitrogen Thermo Scientific | A11012 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-Recoverin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5585 | Dilution 1/500 |
| Anti-Rhodopsin antibody (mouse) | Sigma-Aldrich | MABN15 | Dilution 1/1,000 |
| Anti-S-Opsin antibody (rabbit) | Sigma-Aldrich | AB5407 | Dilution 1/500 |
| Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) | Promega | G3250 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501 | Stock solution 10% |
| bisBenzimide H 33258 (Hoechst) | Sigma-Aldrich | B2883 | Stock solution 10 mg/mL |
| Butanol-1 ≥99.5% | VWR chemicals | 20810.298 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.02382 | Use at 0.1 M |
| Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) | New England Biolabs | M0646T | |
| Clark Capillary Glass model GC100TF-10 | Warner Instruments (Harvard Apparatus) | 30-0038 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) | Sigma-Aldrich | C8661 | Stock solution 100 mM |
| Coverslip 24 x 60 mm | VWR | 631-1575 | |
| Dako REAL ab diluent | Agilent | S202230-2 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Electronic Rotary Microtome | Thermo Scientific | Microm HM 340E | |
| Eosin 1% aqueous | RAL Diagnostics | 312740 | |
| Fluorescein lysine dextran | Invitrogen Thermo Scientific | D1822 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Olympus | SZX 200 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410-B | |
| Glycerin albumin acc. Mallory | Diapath | E0012 | Use at 3% in water |
| Hematoxylin (Mayer's Hemalun) | RAL Diagnostics | 320550 | |
| HEPES potassium salt | Sigma-Aldrich | H0527 | |
| Human chorionic gonadotropin hormone | MSD Animal Health | Chorulon 1500 | |
| Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) | Sigma-Aldrich (SAFC) | 1.00314 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | C7880 | Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0) |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.05886 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich (Supelco) | M3761 | Use at 10 mM |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500 |
| Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent | Millipore | 345789 | |
| Mounting medium, Eukitt | Chem-Lab | CL04.0503.0500 | |
| MX35 Ultra Microtome blade | Epredia | 3053835 | |
| Needle Agani 25 G x 5/8'' | Terumo | AN*2516R1 | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm | Sefar | 06-1000/44 | |
| Paraffin histowax without DMSO | Histolab | 00403 | |
| Paraformaldehyde solution (32%) | Electron Microscopy Sciences | EM-15714-S | Use at 4% in 1x PBS pH 7.4 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | Epredia | 2219 | |
| Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Petri Dish 100 mm | Corning Gosselin | SB93-101 | |
| Petri Dish 55 mm | Corning Gosselin | BP53-06 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x | Euromedex | ET330-A | |
| PicoSpritzer Microinjection system | Parker Instrumentation Products | PicoSpritzer III | |
| Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Polysucrose (Ficoll PM 400 ) | Sigma-Aldrich | F4375 | Use at 3% in 0.1x MBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Powdered fry food : sera Micron Nature | sera | 45475 (00720) | |
| Scissors dissection | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Slide Superfrost | KNITTEL Glass | VS11171076FKA | |
| Slide warmer | Kunz instruments | HP-3 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) | VWR chemicals | 27833.294 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich (Supelco) | 1.06329 | |
| Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) | VWR chemicals | 28217-292 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL | B-BRAUN | 9161406V | |
| trans-activating crRNA (tracrRNA) | Integrated DNA Technologies | 1072533 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator | X-Cite | 200DC | |
| Xylene ≥98.5% | VWR chemicals | 28975-325 |
Riferimenti
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -. J., Perron, M. Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems. Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).
- García-García, D., Locker, M., Perron, M. Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).
- Todd, L., et al. Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors. Cell Reports. 37 (3), 109857 (2021).
- Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
- Langhe, R., et al. Müller glial cell reactivation in Xenopus models of retinal degeneration. Glia. 65 (8), 1333-1349 (2017).
- Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina. Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).
- Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).
- Zahn, N., et al. Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource. Development. 149 (14), (2022).
- McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).
- Parain, K., et al. CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Cells. 11 (5), 807 (2022).
- Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos. Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).
- Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus. bioRxiv. , (2023).
- Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system. Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).
- Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).
- Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration. Biologia dello sviluppo. 353 (1), 10-18 (2011).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).
