الحقن داخل القراب للفأر حديث الولادة لتحرير الجينوم وتوصيل الدواء
Summary
يحدد هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الفئران الوليدية لتحرير الجينات وتوصيل الأدوية.
Abstract
الحقن داخل القراب هو إجراء شائع الاستخدام في كل من عيادات الأطفال والبالغين ، ويعمل كوسيلة فعالة لإدارة الأدوية والعلاجات. من خلال توصيل الأدوية والعلاجات مباشرة إلى السائل النخاعي للجهاز العصبي المركزي ، تحقق هذه الطريقة تركيزات أعلى من الأدوية الموضعية مع تقليل الآثار الجانبية الجهازية مقارنة بالطرق الأخرى مثل الحقن في الوريد أو تحت الجلد أو الحقن العضلي. تمتد أهميته إلى ما هو أبعد من الإعدادات السريرية ، حيث يلعب الحقن داخل القراب دورا حيويا في الدراسات قبل السريرية التي تركز على علاج الاضطرابات العصبية الوراثية في القوارض الكبيرة الأخرى ، بما في ذلك الرئيسيات غير البشرية. ومع ذلك ، على الرغم من تطبيقه على نطاق واسع ، فإن الحقن داخل القراب في الصغار ، وخاصة الجراء حديثي الولادة ، يشكل تحديات تقنية كبيرة بسبب صغر حجمها وطبيعتها الهشة. تتطلب الإدارة الناجحة والموثوقة للحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة اهتماما دقيقا بالتفاصيل ودراسة متأنية للعوامل المختلفة. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى بروتوكول موحد لا يوفر التعليمات فحسب ، بل يسلط الضوء أيضا على الاعتبارات الفنية الرئيسية والممارسات المختبرية الجيدة لضمان الاتساق الإجرائي ، فضلا عن سلامة ورفاهها.
لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، نقدم بروتوكولا مفصلا وشاملا لإجراء الحقن داخل القراب على وجه التحديد في الجراء حديثي الولادة في اليوم الأول بعد الولادة (P1). باتباع التعليمات خطوة بخطوة ، يمكن للباحثين إجراء الحقن داخل القراب بثقة في الجراء حديثي الولادة ، مما يتيح التوصيل الدقيق للأدوية ، و oligos المضادة للحساسية ، والفيروسات لاستبدال الجينات أو العلاجات القائمة على تحرير الجينوم. علاوة على ذلك ، يتم التأكيد على أهمية الالتزام بالممارسات المختبرية الجيدة للحفاظ على رفاهية وضمان نتائج تجريبية موثوقة. يهدف هذا البروتوكول إلى معالجة التحديات التقنية المرتبطة بالحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة ، مما يسهل في نهاية المطاف التقدم في مجال البحوث الوراثية العصبية التي تهدف إلى تطوير التدخلات العلاجية المحتملة.
Introduction
الحقن داخل القراب (IT) هو إجراء سريري شائع يستخدم لإدارة الأدوية ، وجمع السائل النخاعي ، والحفاظ على الضغط داخل الجمجمة في كل من المرضى الأطفال والبالغين في العيادات1،2. يعد إعطاء الأدوية عن طريق الحقن داخل القراب طريقة فعالة لزيادة تركيزات الأدوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) مع تقليل التعرض الجهازي. وبالتالي ، فإن هذه الطريقة تعزز الفعالية العلاجية وتقلل من الآثار الجانبية ، خاصة بالنسبة للأدوية الحساسة للحرارة وقصيرة العمر3.
في الدراسات قبل السريرية التي تختبر عقاقير وعلاجات جديدة باستخدام نماذج القوارض ، من الضروري استخدام طريقة موثوقة لإدارة الأدوية توفر دقة أكبر وقابلية استنساخالنتائج 4,5. بالنسبة للدراسات قبل السريرية التي تقيم العلاجات الجديدة للاضطرابات العصبية الوراثية واضطرابات النمو العصبي ، يعد العلاج المبكر أمرا بالغ الأهمية لدراسات إثبات المفهوم الأولية لأنه من المتوقع عادة أن تسفر التدخلات السابقة عن نتائج أكثر ملاءمة6،7،8.
بالمقارنة مع الحقن التقليدية داخل بطانة الرحم البطينية (ICV) ، فإن حقن تكنولوجيا المعلومات تحمل مخاطر أقل بكثير لأنها تتجنب الحاجة إلى الاختراق المباشر من خلال القشرة الدماغية. هذه الميزة تقلل بشكل كبير من الضرر المحتمل للأنسجة القشرية الإقليمية والأعصاب المحيطة. علاوة على ذلك ، تسمح حقن تكنولوجيا المعلومات بزيادة خمسة أضعاف على الأقل في الحجم القابل للإدارة من الأدوية من خلال حقنة واحدة ، مما يعزز بشكل كبير جدوى الإدارات المتكررة. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم الفئران حديثي الولادة وطبيعتها الهشة ، فإن إجراء الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة يمثل تحديا تقنيا ويتطلب تقنيات ومعدات متخصصة ومعالجة دقيقة.
توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا مع إرشادات خطوة بخطوة لإجراء الحقن داخل القراب في الجراء حديثي الولادة P1. يتم التأكيد هنا على الاعتبارات الرئيسية والممارسات المختبرية الجيدة لضمان اتساق الإدارة وسلامة ورفاهية أثناء الإجراء. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين إجراء تجارب بثقة بدقة وقابلية للتكرار مع تقليل أي مخاطر محتملة أو إزعاج للحيوانات.
Protocol
Representative Results
Discussion
الموصوف هو إجراء خطوة بخطوة للحقن داخل القراب في الفئران حديثي الولادة (P1) ، مما يؤدي إلى توزيع الأدوية على نطاق واسع في أدمغتهم. بالمقارنة مع طريقة الحقن داخل المخ البطيني الشائعة لتوصيل الدواء إلى الفئران حديثي الولادة ، والتي تتضمن ثقب القشرة الدماغية11 ، فإن الحقن داخل الق?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم XNL من قبل مؤسسة زمالة ما بعد الدكتوراه العلاجية لمتلازمة أنجلمان (FAST). YHJ هو أيضا دعم من قبل FAST و NIH Grant R01HD110195 و R01MH117289.
Materials
| Balance | Ohaus Corporation | 30253017 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Digital Microscope | RWD | DOM-1001 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190144 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Heating pad | RWD | 69020 | |
| Needles | Hamilton | 6PK (34/0.375”/4/12DEG)S | |
| Syringe | Hamilton | 1702RN | |
| Syringe Filters | Sigma | SLGVM33RS |
Riferimenti
- Hoy, S. M. Onasemnogene abeparvovec: first global approval. Drugs. 79 (11), 1255-1262 (2019).
- Ramos, D. M., et al. Age-dependent SMN expression in disease-relevant tissue and implications for SMA treatment. J Clin Invest. 129 (11), 4817-4831 (2019).
- Fedorova, E., Battini, L., Prakash-Cheng, A., Marras, D., Gusella, G. L. Lentiviral gene delivery to CNS by spinal intrathecal administration to neonatal mice. J Gene Med. 8 (4), 414-424 (2006).
- Dindot, S. V., et al. An ASO therapy for Angelman syndrome that targets an evolutionarily conserved region at the start of the UBE3A-AS transcript. Sci Transl Med. 15, eabf4077 (2023).
- Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389 (2022).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-Thalassemia. N Engl J Med. 384, 252-260 (2021).
- Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing for transthyretin amyloidosis. N Engl J Med. 385, 493-502 (2021).
- Krol, A., Feng, G. Windows of opportunity: timing in neurodevelopmental disorders. Curr Opin Neurobiol. 48, 59-63 (2018).
- Birg, T., et al. Brain temperature influences intracranial pressure and cerebral perfusion pressure after traumatic brain injury: A CENTER-TBI Study. Neurocrit Care. 35, 651-661 (2021).
- Rossi, S., Zanier, E. R., Mauri, I., Columbo, A., Stocchetti, N. Brain temperature, body core temperature, and intracranial pressure in acute cerebral damage. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 71 (4), 448-454 (2001).
- Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. J Vis Exp. 91, e51863 (2014).
- Petrou, P., Kassis, I., Yaghmour, N. E., Ginzberg, A., Karussis, D. A phase II clinical trial with repeated intrathecal injections of autologous mesenchymal stem cells in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Front Biosci (Landmark Ed). 26 (10), 693-706 (2021).
- Kroin, J. S., et al. The mechanisms of intracranial pressure modulation by epidural blood and other injectates in a postdural puncture rat model. Anesth Analg. 95 (2), 423-429 (2002).
- Møllgård, K., et al. A mesothelium divides the subarachnoid space into functional compartments. Science. 379 (6627), 84-88 (2023).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8, e67680 (2013).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 160-107, 1-16 (2013).
